检测产志贺毒素大肠杆菌抗体的间接ELISA试剂盒的研制

发布时间：2023-04-26 02:54

　　本研究旨在研制一种以紧密素为检测靶标的间接ELISA技术,检测血清中产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxigenic Escherichia coli,STEC)的抗体水平。根据紧密素27个亚型的N端保守序列,体外表达390⁵43 aa片段制备包被抗原,通过敏感性、特异性、重复性和稳定性实验,建立检测STEC的抗体的间接EIISA方法。经优化筛选的间接ELISA最佳反应条件:抗原包被浓度3 ng/孔,待检血清稀释比例1∶200,HRP-兔抗羊Ig G、HRP-兔抗牛Ig G的工作浓度均为1∶15000,5%脱脂奶封闭l h,底物作用时间10min,用于牛、羊疫苗抗体检测或者STEC大肠杆菌感染的监测。

【文章页数】：8 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 主要试剂
    1.2 引物设计及合成
    1.3 重组蛋白表达、纯化和Western blotting检测
    1.4 间接ELISA方法的建立
        1.4.1 重组蛋白抗原最适包被浓度及待检血清稀释浓度的确定
        1.4.2 重组抗原包被条件的确定
        1.4.3 封闭液以及封闭时间的确定
        1.4.4 酶标二抗稀释倍数和作用时间的确定
        1.4.5 血清最佳作用时间的确定
        1.4.6 底物反应时间的确定
        1.4.7 不同种属酶标Ig G的比较
        1.4.8 特异性交叉试验
        1.4.9 阴阳性临界值
    1.5 重复性实验
        1.5.1 批内重复实验
        1.5.2 批间重复实验
    1.6 ELISA方法检测免疫动物的抗体滴度
        1.6.1 免疫牛抗体检测
        1.6.2 山羊抗体检测
2 结果与分析
    2.1 重组蛋白表达和Western blotting鉴定
    2.2 间接ELISA方法的建立
        2.2.1 最适抗原包被浓度和血清稀释度的确定
        2.2.2 抗原包被条件、封闭条件和酶标Ig G的工作条件优化
        2.2.3 显色时间优化
        2.2.4 不同种属酶标二抗的比较
        2.2.5 阴阳性临界值确定
        2.2.6 特异性交叉试验
    2.3 重复性检测
    2.4 ELISA试剂盒检测免疫动物的抗体
        2.4.1 免疫牛抗体检测
        2.4.2 山羊抗体检测
3 讨论



本文编号：3801593