褪黑素对深色有隔内生真菌（DSE）嗜鱼外瓶霉重金属耐性形成的影响

发布时间：2024-01-31 07:12

　　深色有隔内生真菌(Dark septate endophytes,DSE)是一类广泛定殖于植物根内的内生真菌。实验室前期分离得到了一株重金属高度耐受的DSE菌株嗜鱼外瓶霉(Exophialapisciphila,H93),转录组分析发现Cd2+胁迫上调了褪黑素合成酶基因(TDC、SNAT、ASMT)的表达。褪黑素(Melatonin)是一种古老的抗氧化小分子,在提高生物体的重金属胁迫耐性上发挥着重要作用。为探究H93菌株中褪黑素与重金属耐性之间的联系,首先利用施加外源褪黑素的方式探究褪黑素介导H93菌株的重金属耐性;然后对H93菌株褪黑素合成酶基因进行生物信息分析;探讨在重金属(Cd2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+)胁迫下H93菌株褪黑素合成水平及其合成酶基因的响应模式;用大肠杆菌诱导表达体系对H93两个褪黑素合成酶基因EpTDC、EpASMT进行了诱导表达以获取其酶活特征,构建了E这TDC、EpASMT大肠杆菌和拟南芥过表达株,以异源过表达的方式研究了褪黑素合成酶基因与重金属耐性之间的关系及可能的机制。研究主要结果如下:1.外源褪黑素主要通过调控H93重金属吸收和转运系统、或直接鳌...

【文章页数】：104 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 研究背景
    1 深色有隔内生真菌嗜鱼外瓶霉(Exophiala pisciphila,H93)重金属耐性
    2 褪黑素与重金属耐性
    3 褪黑素的生物合成途径
    4 褪黑素的合成调控
    5 本文主要研究内容及意义
    6 技术路线
第二章 外源褪黑素的施加对H93重金属耐性的影响
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 菌株
        2.2 主要仪器设备、试剂
        2.3 培养基及试剂的配制
            2.3.1 培养基的配制
            2.3.2 溶液的配制
        2.4 实验方法
            2.4.1 菌株的培养及收集
            2.4.2 重金属含量的测定
            2.4.3 SOD、MDA、OFR和蛋白质含量的测定
        2.5 数据处理与分析
    3 结果分析
        3.1 Cd²⁺胁迫下H93中Cd、SOD、MDA、OFR积累特征
        3.2 Cu²⁺胁迫下H93中Cu²⁺、SOD、MDA、OFR积累特征
        3.3 Zn²⁺胁迫下H93中Zn²⁺、SOD、MDA、OFR积累特征
        3.4 Pb²⁺胁迫下H93中Pb²⁺、SOD、MDA、OFR积累特征
    4 讨论
第三章 褪黑素合成酶(EpTDC、EpSNAT、EpASMT)生物信息学分析
    1 前言
    2 材料和方法
    3 结果分析
        3.1 褪黑素合成酶基因保守结构域分析
        3.2 蛋白质亲疏水性分析
        3.3 蛋白质结构预测
        3.4 信号肽预测分析
        3.5 蛋白质二级结构预测
        3.6 亚细胞定位分析
        3.7 褪黑素合成酶基因进化分析
    4 讨论
第四章 H93褪黑素及其合成酶基因对不同重金属胁迫的响应
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 菌株
        2.2 主要仪器设备、试剂
        2.3 试剂的配制
        2.4 实验方法
            2.4.1 H93菌株的培养
            2.4.2 H93褪黑素的含量测定
            2.4.3 H93总RNA的提取
            2.4.4 cDNA反转录
            2.4.5 荧光定量PCR引物的设计
            2.4.6 荧光定量PCR
        2.5 实验数据的分析
    3 结果分析
        3.1 Cd²⁺胁迫下不同时间,H93褪黑素含量及TDC、SNAT、ASMT表达量的响应分析
        3.2 Cu²⁺胁迫下不同时间,H93褪黑素含量及TDC、SNAT、ASMT表达量的响应分析
        3.3 Zn²⁺胁迫下不同时间,H93褪黑素含量及TDC、SNAT、ASMT表达量的响应分析
        3.4 Pb²⁺胁迫下不同时间,H93褪黑素含量及TDC、SNAT、 ASMT表达量的响应分析
    4 讨论
第五章 H93褪黑素合成酶基因蛋白表达分析
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 菌株与质粒
        2.2 主要仪器设备、试剂
        2.3 培养基与试剂的配制
        2.4 实验方法
            2.4.1 TDC、ASMT基因的克隆
                2.4.1.1 H93cDNA模板第一条链的合成
                2.4.1.2 TDC、ASMT扩增引物
                2.4.1.3 EpTDC、EpASMT PCR扩增
                2.4.1.4 TDC、ASMT PCR产物的回收和检测
                2.4.1.5 产物连接克隆载体
                2.4.1.6 连接产物的转化
                2.4.1.7 阳性克隆的筛选与鉴定
            2.4.2 TDC、ASMT的诱导表达
                2.4.2.1 含有TDC、ASMT片段的pMD-18T克隆质粒的提取
                2.4.2.2 含酶切位点的EpTDC、EpASMT的扩增
                2.4.2.3 质粒双酶切
                2.4.2.4 酶切产物的连接
                2.4.2.5 表达载体转化BL21(DE3)
                2.4.2.6 蛋白质的诱导表达
                2.4.2.7 SDS-PAGE检测
            2.4.3 酶活性分析
                2.4.3.1 粗酶的提取
                2.4.3.2 酶促反应
                2.4.3.3 HPLC分析
        2.5 数据处理与分析
    3 实验结果
        3.1 EpTDC、EpASMT扩增结果
        3.2 表达载体酶切验证结果
        3.3 蛋白诱导表达结果
        3.4 粗酶催化结果
    4 讨论
第六章 大肠杆菌、拟南芥异源表达EpTDC、EpASMT重金属耐性分析
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 菌株、质粒及拟南芥种子
        2.2 主要仪器设备、试剂
        2.3 培养基的配法
        2.4 实验方法
            2.4.1 不同重金属胁迫下,EpTDC、EpASMT大肠杆菌异源过表达株生物量的测定
            2.4.2 植物表达载体的构建
                2.4.2.1 含酶切位点EpTDC、EpASMT的PCR扩增
                2.4.2.2 质粒的双酶切
            2.4.3 根癌农杆菌感受态制备
            2.4.4 根癌农杆菌的转化
            2.4.5 根癌农杆菌转化拟南芥
                2.4.5.1 拟南芥的种植
                2.4.5.2 拟南芥的转化
                2.4.5.3 拟南芥抗性苗的筛选与鉴定
            2.4.6 拟南芥转化株平板重金属耐性实验
            2.4.7 拟南芥转化株Cd²⁺含量的测定
        2.5 数据处理与分析
    3 实验结果
        3.1 拟南芥表达载体的酶切验证
        3.2 转基因拟南芥植株PCR验证结果
        3.3 重金属胁迫下,大肠杆菌过表达株生物量的变化
            3.3.1 不同重金属胁迫下,EpTDC大肠杆菌过表达株的生物量
            3.3.2 不同重金属胁迫下,EpASMT大肠杆菌过表达株的生物量
        3.4 不同重金属胁迫下,转基因拟南芥生长情况和生物量的测定
            3.4.1 Cd²⁺胁迫下EpTDC拟南芥过表达株生长情况
            3.4.2 Cu²⁺胁迫下EpTDC拟南芥过表达株生长情况
            3.4.3 Zn²⁺胁迫下EpTDC拟南芥过表达株生长情况
            3.4.4 Pb²⁺胁迫下EpTDC拟南芥过表达株生长情况
            3.4.5 Cd²⁺胁迫下EpASMT拟南芥过表达株生长情况
            3.4.6 Cu²⁺胁迫下EpASMT拟南芥过表达株生长情况
            3.4.7 Zn²⁺胁迫下EpASMT拟南芥过表达株生长情况
            3.4.8 Pb²⁺胁迫下EpASMT拟南芥过表达株生长情况
        3.5 EpTDC、EpASMT过表达株体内Cd²⁺积累的特征
    4 讨论
第七章 全文总结与展望
    1 本文主要结论
    2 本研究的创新点
    3 展望
附录
    附录1 EpTDC碱基序列
    附录2 EpSNAT碱基序列
    附录3 EpASMT碱基序列
    附录4 质粒图谱
        附录4.1 pET28a原核表达载体图谱
        附录4.2 Pcambial304拟南芥表达载体图谱
    附录5. 培养基、试剂的配制
参考文献
攻读硕士学位期间完成的科研成果
致谢



本文编号：3891188