重组几丁质酶水解黑曲霉菌丝体生产N-乙酰葡萄糖胺

发布时间：2024-02-18 18:15

　　N-乙酰葡萄糖胺是一种具有多种生物活性的单糖,广泛应用于食品、药品及化妆品行业。酶法降解几丁质生产N-乙酰葡萄糖胺因其工艺条件温和,绿色环保,具有很好的发展前景。黑曲霉菌丝体作为发酵工业废弃物是一种廉价且具有安全性的几丁质原料,因此针对黑曲霉菌丝体进行酶法生产N-乙酰葡萄糖胺工艺的探索具有较高的研究与应用价值。本文以酶法水解黑曲霉菌丝体为出发点,克隆表达并表征了一种来自黑曲霉的几丁质酶AnChi,并对AnChi在生产中的应用进行了探索。本论文包括以下研究内容:(1)通过序列比对与同源模建分析对AnChi的功能进行预测,发现其具有高度保守的GH18家族几丁质酶结构,推测其具有几丁质酶活性,而且底物亲和力较低。(2)构建了大肠杆菌表达质粒pET-28a-AnChi并成功转化至大肠杆菌BL21(DE3),使用IPTG诱导表达得到C端含有组氨酸标签的AnChi,通过金属螯合层析分离纯化,得到高纯度的AnChi,表达量可达到40 mg/L。(3)对AnChi的酶学性质进行表征,测得最适温度40℃,最适pH为6.0,同时测得其对4-MU-β-(GlcNAc)₂与乙二醇几丁质的...

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
引言
1 综述
    1.1 N-乙酰葡萄糖胺的应用
        1.1.1 N-乙酰葡萄糖胺
        1.1.2 N-乙酰葡萄糖胺的应用
    1.2 N-乙酰葡萄糖胺的生产原料
    1.3 N-乙酰葡萄糖胺的制备方法
        1.3.1 化学方法生产GlcNAc
        1.3.2 酶催化法生产
        1.3.3 酶法生产GlcNAc的改良工艺
        1.3.4 生物转化法
    1.4 N-乙酰葡萄糖胺生产过程中的酶
        1.4.1 GH18家族几丁质酶
        1.4.2 GH19家族几丁质酶
        1.4.3 GH20家族N-乙酰己糖胺酶
    1.5 选题依据与研究内容
        1.5.1 选题依据
        1.5.2 研究内容
2 AnChi的氨基酸序列分析
    2.1 引言
    2.2 实验材料与方法
    2.3 实验结果与讨论
        2.3.1 氨基酸序列比对分析
        2.3.2 同源模建分析
    2.4 小结
3 AnChi的重组表达、分离纯化与性质表征
    3.1 引言
    3.2 实验材料与方法
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 pET-28a-AnChi表达载体的构建
        3.2.3 AnChi在大肠杆菌中的重组表达
        3.2.4 AnChi的分离纯化
        3.2.5 AnChi的酶学性质表征
        3.2.6 AnChi对复杂底物的水解实验
    3.3 实验结果与讨论
        3.3.1 质粒pET-28a-AnChi的构建与表达
        3.3.2 质粒pET-28a-AnChi’的构建与表达
        3.3.3 AnChi的分离与纯化
        3.3.4 AnChi的酶学性质表征
        3.3.5 AnChi的复杂底物水解实验
    3.4 小结
4 AnChi在枯草芽孢杆菌中的重组表达及应用
    4.1 引言
    4.2 实验材料与方法
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 pDG1663-AnChi表达载体的构建
        4.2.3 AnChi在枯草芽孢杆菌中的重组表达
        4.2.4 AnChi的粗分离与鉴定
        4.2.5 AnChi粗酶液对菌丝体的水解实验
        4.2.6 AnChi水解菌丝体的产物鉴定与纯化
        4.2.7 AnChi粗酶液的底物富集实验
    4.3 实验结果与讨论
        4.3.1 pDG1663-AnChi表达载体的构建
        4.3.2 AnChi在枯草芽孢杆菌中的重组表达与优化
        4.3.3 枯草芽孢杆菌发酵液粗分离与AnChi的鉴定
        4.3.4 AnChi粗酶液对菌丝体的水解实验
        4.3.5 AnChi的底物富集实验
    4.4 小结
结论
展望
参考文献
附录 AnChi的DNA序列与编码氨基酸序列
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢



本文编号：3902318