两种Vip3Aa蛋白处理的小地老虎中肠转录组差异研究

发布时间：2024-02-14 13:02

　　苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前世界上应用最广泛、环保的生物杀虫剂。营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Protein,VIP)是继杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)后发现的具有显著代表性的一类新型杀虫蛋白。Vip3Aa蛋白是营养期杀虫蛋白中研究最为普遍的蛋白,这类蛋白的氨基酸序列同源性很高,并且对鳞翅目昆虫具有很高的杀虫活性。但是不同Bt来源的ViP3Aa蛋白的杀虫谱和杀虫活性有所不同。Vip3Aa11和Vip3Aa39分别从Bt菌株C9和T03B001中分离得到,这两种蛋白存在39个氨基酸差异位点,氨基酸序列相似性较高,为95.06%。但是他们对某些鳞翅目昆虫表现出的不同杀虫活性。例如这两种蛋白对鳞翅目昆虫小地老虎(Agrotis ipsilon)的杀虫活性存在一定差异,LC50分别为 73.62 μg/mL(43.20～115.03)和5.43 μg/mL(2.34～11.19)。为了探究这两种蛋白对同一种昆虫产生杀虫活性差异的原因,本研究以小地老虎为靶标对...

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【学位级别】：博士

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摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 苏云金芽胞杆菌
    1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白
        1.2.1 杀虫晶体蛋白的分类及杀虫活性
        1.2.2 杀虫晶体蛋白的结构与功能
        1.2.3 杀虫晶体蛋白的应用与面临的问题
    1.3 苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白
        1.3.1 营养期杀虫蛋白Vip1A/Vip2A二元毒素
        1.3.2 营养期杀虫蛋白Vip3A
    1.4 营养期杀虫蛋白Vip3A应用
        1.4.1 构建Bt工程菌
        1.4.2 Vip3A在转基因植物中的应用
    1.5 小地老虎
        1.5.1 小地老虎的分类地位及其危害
        1.5.2 小地老虎的主要防治措施及其存在的问题
    1.6 高通量转录组测序技术在昆虫上的应用
        1.6.1 转录组学研究
        1.6.2 转录组学研究手段
        1.6.3 昆虫转录组学
    1.7 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 试剂
        2.1.3 仪器设备
        2.1.4 供试昆虫
    2.2 研究方法
        2.2.1 vip3Aa基因的克隆
        2.2.2 基因扩增引物
        2.2.3 DNA回收
        2.2.4 E.coli感受态细胞制备
        2.2.5 酶切反应
        2.2.6 连接反应
        2.2.7 大肠杆菌热激转化
        2.2.8 E.coli质粒DNA提取
        2.2.9 vip3Aa基因在大肠杆菌中诱导表达
        2.2.10 Vip3Aa蛋白的纯化
        2.2.11 纯化蛋白的生物素标记
        2.2.12 蛋白质的电泳检测
        2.2.13 用于转录组测序试虫的饲喂处理
        2.2.14 小地老虎中肠组织的提取
        2.2.15 RNA的提取与检测
        2.2.16 cDNA合成
        2.2.17 转录组测序数据过滤及De novo组装
        2.2.18 转录组测序数据功能注释
        2.2.19 差异表达基因的检测及聚类分析
        2.2.20 差异表达基因的GO功能分析及Pathway功能分析
        2.2.21 差异表达基因的qRT-PCR验证
        2.2.22 供试昆虫中肠组织BBMV的提取
        2.2.23 结合及竞争结合实验
        2.2.24 Ligand blot实验
3 结果与分析
    3.1 小地老虎中肠转录组测序
        3.1.1 vip3Aa基因的克隆及表达载体的构建
        3.1.2 Vip3Aa蛋白的表达及纯化
        3.1.3 供试昆虫中肠RNA样品的提取及质量检测
        3.1.4 转录组测序及序列组装
        3.1.5 Unigene功能注释
        3.1.6 维恩图分析
        3.1.7 Unigene的CDS和TF编码能力预测及SSR和SNP检测
    3.2 差异表达基因分析
        3.2.1 差异表达基因的检测
        3.2.2 差异表达基因的统计分析
        3.2.3 差异表达基因的聚类分析
        3.2.4 差异表达基因的GO功能分析
        3.2.5 差异表达基因的Pathway功能分析
        3.2.6 qRT-PCR验证
    3.3 小地老虎中肠对Vip3Aa应答相关基因的鉴定
        3.3.1 差异表达基因中与免疫相关的基因的鉴定
        3.3.2 差异表达基因中与代谢相关的基因的鉴定
        3.3.3 差异表达基因中Bt毒素潜在受体蛋白基因的鉴定
        3.3.4 差异表达基因中与消化作用相关基因的鉴定
    3.4 Vip3Aa11蛋白与Vip3Aa39蛋白杀虫活性差异分析
        3.4.1 Vip3Aa11与Vip3Aa39蛋白的胰蛋白酶消化
        3.4.2 Vip3Aa11与Vip3Aa39蛋白与供试昆虫中肠BBMV的体外结合
4 讨论
5 结论
致谢
参考文献
攻读博士学位期间发表的学术论文



本文编号：3898155