细胞色素P450介导B、Q烟粉虱药剂敏感性差异的分子机制

发布时间：2024-02-15 09:21

　　烟粉虱Bemisia tabaci是一种世界性重大农业害虫,常年危害造成农作物减产30-50%,甚至毁种绝收。实验室长期监测结果发现,Q烟粉虱已经取代先前占据主要生态位的B烟粉虱,证实杀虫剂使用是导致Q烟粉虱取代B烟粉虱的关键生态机制,同时生化研究表明Q烟粉虱P450解毒酶活性显著性高于B烟粉虱。在此基础上,本研究从烟粉虱P450家族基因入手,运用生理生化、细胞生物学和毒理学的研究手段,最终揭示P450基因介导B、Q烟粉虱药剂敏感性差异的分子作用机理。主要研究结论如下:1.B、Q烟粉虱P450家族基因序列差异及进化特点:明确B、Q烟粉虱P450基因的数量分别为166和158条,分为4个Clans;系统发育树结果表明,与褐飞虱相比,B、Q烟粉虱P450基因Clan 3和Clan 4存在明显扩张,这可能与B、Q烟粉虱世界性范围分布且强的环境适应性有关。2.B、Q烟粉虱P450基因对吡虫啉响应差异:q PCR结果表明,吡虫啉药剂处理后,对于Q烟粉虱,一共有14个P450基因的表达量要高于B烟粉虱(CYP6JK1,CYP6DZ8,CYP6DZ9,CYP6DZ3,CYP6DW4,CYP6CM1,...

【文章页数】：119 页

【学位级别】：博士

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摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 烟粉虱概述
    1.2 烟粉虱的生物型以及B、Q烟粉虱在中国入侵历史规律
    1.3 Q替代B烟粉虱的生态机制
        1.3.1 寄主植物
        1.3.2 番茄黄化曲叶病毒
        1.3.3 杀虫剂
    1.4 烟粉虱抗药性及抗性机制研究
        1.4.1 烟粉虱抗药性研究
        1.4.2 烟粉虱抗药性机制研究
    1.5 昆虫细胞色素P450酶系
        1.5.1 细胞色素P450的分类与命名
        1.5.2 细胞色素P450基因序列的多样性
        1.5.3 细胞色素P450等位基因变异与拷贝数变化
        1.5.4 细胞色素P450蛋白的结构特征
        1.5.5 细胞色素P450蛋白与异源物质的反应类型
        1.5.6 昆虫细胞色素P450蛋白的功能
    1.6 研究目的、研究内容和技术路线
        1.6.1 研究目的
        1.6.2 研究内容
        1.6.3 技术路线
第二章 B、Q烟粉虱细胞色素P450基因鉴定及进化关系分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 供试虫源
        2.1.2 P450基因数据来源
        2.1.3 P450基因分析工具
        2.1.4 B、Q烟粉虱P450基因序列鉴定及分析
        2.1.5 B、Q烟粉虱P450基因进化关系分析
        2.1.6 B、Q烟粉虱RNA的提取
        2.1.7 cDNA的合成(反转录)
        2.1.8 B、Q烟粉虱P450基因序列的验证
    2.2 结果与分析
        2.2.1 B、Q烟粉虱P450基因的鉴定
        2.2.2 B、Q烟粉虱P450基因序列的验证
        2.2.3 B、Q烟粉虱P450基因系统进化关系分析
        2.2.4 B、Q烟粉虱P450序列的结构特征
        2.2.5 B、Q烟粉虱P450基因表达模式分析
    2.3 讨论
第三章 B、Q烟粉虱P450基因对吡虫啉的诱导表达分析
    3.1 材料与方法
        3.1.1 供试虫源
        3.1.2 B、Q烟粉虱吡虫啉的处理
        3.1.3 B、Q烟粉虱RNA的提取以及c DNA合成
        3.1.4 P450基因定量引物的筛选
        3.1.5 B、Q烟粉虱药剂处理后P450表达量变化
    3.2 结果与分析
        3.2.1 定量引物的筛选
        3.2.2 Q烟粉虱吡虫啉药剂处理结果
        3.2.3 B烟粉虱吡虫啉药剂处理结果
        3.2.4 B、Q烟粉虱药剂处理结果比较
    3.3 讨论
第四章 B、Q烟粉虱田间种群P450基因组成型表达分析
    4.1 材料与方法
        4.1.1 供试虫源
        4.1.2 B、Q烟粉虱P450组成型表达分析
        4.1.3 田间烟粉虱RNA的提取以及c DNA的合成
        4.1.4 荧光定量PCR
    4.2 结果与分析
        4.2.1 海南辣椒种群Q与室内种群Q比较
        4.2.2 山西棉花种群Q与室内种群Q比较
        4.2.3 湖南棉花种群与室内种群的比较
        4.2.4 田间B种群与室内种群的比较
    4.3 讨论
第五章 B、Q烟粉虱P450 家族基因表达量差异的RNAi功能研究
    5.1 材料与方法
        5.1.1 供试虫源
        5.1.2 dsRNA的合成
        5.1.3 dsRNA的饲喂
        5.1.4 荧光定量PCR
        5.1.5 吡虫啉的生物测定
    5.2 结果与分析
        5.2.1 RNA干扰效率的检测
        5.2.2 Q烟粉虱RNA干扰后生物测定
        5.2.3 B烟粉虱RNA干扰后生物测定
    5.3 讨论
第六章 NADPH细胞色素P450 氧化酶的克隆及功能分析
    6.1 材料与方法
        6.1.1 供试虫源
        6.1.2 NADPH细胞色素P450 氧化酶基因的克隆
        6.1.3 NADPH细胞色素P450 氧化酶基因的生物信息学分析
        6.1.4 烟粉虱CPR的时空表达分析
        6.1.5 ds RNA合成和RNA干扰
        6.1.6 烟粉虱CPR基因p Fast Bac HTA质粒构建以及无内毒素质粒提取
        6.1.7 SF9细胞复苏、质粒转染以及CPR蛋白表达
        6.1.8 烟粉虱CPR蛋白酶活测定和细胞毒理测定
    6.2 结果与分析
        6.2.1 烟粉虱CPR基因的克隆和生物信息学分析
        6.2.2 昆虫CPR基因系统进化树关系分析
        6.2.3 烟粉虱CPR基因时空表达分析
        6.2.4 烟粉虱CPR基因干扰后对吡虫啉抗性的影响
        6.2.5 干扰野外烟粉BtCPR基因后的影响
        6.2.6 体外表达BtCPR蛋白、细胞毒性测定以及酶活动力曲线研究
    6.3 讨论
第七章 烟粉虱P450 基因的体外表达及HPLC-MS分析
    7.1 材料与方法
        7.1.1 供试虫源
        7.1.2 烟粉虱P450基因的克隆、胶回收
        7.1.3 烟粉虱P450基因质粒构建以及无内毒素质粒的提取
        7.1.4 P450质粒的转染与蛋白的表达
        7.1.5 P450蛋白的提取与活性检测
        7.1.6 P450 蛋白与吡虫啉体外反应以及HPLC-MS分析
    7.2 结果与分析
        7.2.1 P450 基因p Fast HTA质粒构建以及P450 酶活性检测
        7.2.2 P450代谢吡虫啉活性检测结果
    7.3 讨论
第八章 B、Q烟粉虱CYP6CM1 基因多态性变异
    8.1 材料与方法
        8.1.1 供试虫源
        8.1.2 烟粉虱RNA的提取和c DNA的合成
        8.1.3 B、Q烟粉虱CYP6CM1 基因多态性检测
    8.2 结果与分析
        8.2.1 B、Q烟粉虱CYP6CM1 基因多态性比较
    8.3 讨论
第九章 结论
参考文献
附录 A
附录 B
致谢
作者简历



本文编号：3899525