鸡γ-干扰素基因克
发布时间：2023-08-30 00:14
鸡γ干扰素(Chicken interferon-gamma, ChIFN-γ)具有较强的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用,作为生物药剂和疫苗佐剂具有广阔的应用前景。正常情况下,机体产生IFN-γ的数量很有限,一定程度上限制了IFN-γ的应用。本实验主要采用重组DNA和基因表达技术,通过RT-PCR方法成功克隆鸡IFN-γ基因,并对其基因序列进行了分析,旨在为大量制备和生产高效廉价的鸡IFN-γ及其体外大量表达作好准备。在体外鸡IFN-γ生物学活性研究基础上,联合禽流感灭活疫苗免疫研究机体的免疫应答反应,对鸡IFN-γ的免疫增强作用进行了研究。 根据GenBank发表的ChIFN-γ基因序列,设计了一对引物,采用RT-PCR方法,从激活的脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出ChIFN-γ基因序列。琼脂糖凝胶电泳显示扩增出的片段约为495 bp。经过双酶切、PCR鉴定和测序结果显示,克隆的ChIFN-γ基因与GenBank发表的鸡IFN-γ基因序列同源性为99.8%。将扩增的ChIFN-γ克隆至原核表达载体pET30a上,构建了重组表达质粒pET-30a-ChIFN-γ。将其转入大肠杆菌BL21 (...
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
1 前言
1.1 禽流感概述
1.1.1 禽流感流行现状
1.1.2 禽流感病毒分子生物学特征
1.1.3 基因组的结构及其编码蛋白的功能
1.1.4 禽流感疫苗
1.2 干扰素概述
1.2.1 IFN 分类及性质
1.2.2 IFN-γ产生及诱导剂
1.2.3 IFN-γ生物学活性
1.2.4 IFN-γ的应用
1.3 研究目的和意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 试验动物
2.1.2 病毒株
2.1.3 细胞株、菌株及载体
2.1.4 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂盒
2.1.5 主要生化试剂
2.1.6 主要实验仪器设备
2.2 试验方法
2.2.1 鸡脾淋巴细胞总RNA 分离
2.2.2 鸡IFN-γ基因RT-PCR 扩增
2.2.3 PCR 扩增片段克隆
2.2.4 重组质粒鉴定
2.2.5 鸡IFN-γ基因重组表达载体构建
2.2.6 重组表达质粒鉴定
2.2.7 重组鸡IFN-γ在大肠杆菌表达系统中诱导表达
2.2.8 融合蛋白纯化
2.2.9 免疫印记分析
2.2.10 重组蛋白对VSV 感染细胞细胞病变的抑制
2.2.11 多克隆抗体制备
2.2.12 多克隆抗体鉴定
2.2.13 重组鸡γ干扰素对禽流感灭活苗的免疫增强效应
2.3 数据处理
3 试验结果
3.1 鸡 IFN-γ 基因克隆与序列测定
3.1.1 鸡脾淋巴细胞总RNA 分离
3.1.2 RT-PCR 法扩增鸡IFN-γ基因序列
3.1.3 重组质粒pMD18-T-ChIFN-γ的鉴定
3.1.4 ChIFN-γ序列测定及分析
3.2 鸡 IFN-γ 基因在大肠杆菌中的表达及多克隆抗体制备
3.2.1 重组表达质粒鉴定
3.2.2 融合蛋白表达、鉴定与纯化
3.2.3 重组蛋白生物活性检测
3.2.4 多抗血清效价及特异性鉴定
3.3 禽流感HI 抗体水平测定
3.4 雏鸡免疫器官及血液T、B 淋巴细胞增殖功能动态变化
3.4.1 雏鸡胸腺T 淋巴细胞增殖功能动态变化
3.4.2 雏鸡脾脏T 淋巴细胞增殖功能动态变化
3.4.3 雏鸡血液T 淋巴细胞增殖功能动态变化
3.4.4 雏鸡脾脏B 淋巴细胞增殖功能动态变化
3.4.5 雏鸡血液B 淋巴细胞增殖功能动态变化
3.5 雏鸡免疫器官及血液不同亚型T 淋巴细胞数量动态变化
3.5.1 雏鸡免疫器官及血液CD4+ T 淋巴细胞动态变化
3.5.2 雏鸡免疫器官及血液CD8+ T 淋巴细胞动态变化
3.6 雏鸡体重增长测定
3.7 免疫器官指数测定
3.8 禽流感病毒感染雏鸡病理学观察
3.9 免疫攻毒保护率
4 讨论
4.1 鸡 IFN-γ 基因克隆与表达
4.1.1 鸡IFN-γ基因克隆与序列
4.1.2 鸡IFN-γ基因表达、纯化与生物活性
4.1.3 多克隆抗体制备及鉴定
4.2 ChIFN-γ 对禽流感灭活苗免疫增强效应
4.2.1 雏鸡免疫后HI 抗体水平变化
4.2.2 雏鸡免疫后T、B 淋巴细胞增殖功能变化
4.2.3 雏鸡免疫后不同亚型T 细胞数量动态变化
4.2.4 雏鸡增重及免疫器官指数变化
4.2.5 禽流感病毒攻击雏鸡病理学变化及免疫保护率
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
本文编号：3844559
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
1 前言
1.1 禽流感概述
1.1.1 禽流感流行现状
1.1.2 禽流感病毒分子生物学特征
1.1.3 基因组的结构及其编码蛋白的功能
1.1.4 禽流感疫苗
1.2 干扰素概述
1.2.1 IFN 分类及性质
1.2.2 IFN-γ产生及诱导剂
1.2.3 IFN-γ生物学活性
1.2.4 IFN-γ的应用
1.3 研究目的和意义
2 材料与方法
2.1 试验材料
2.1.1 试验动物
2.1.2 病毒株
2.1.3 细胞株、菌株及载体
2.1.4 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂盒
2.1.5 主要生化试剂
2.1.6 主要实验仪器设备
2.2 试验方法
2.2.1 鸡脾淋巴细胞总RNA 分离
2.2.2 鸡IFN-γ基因RT-PCR 扩增
2.2.3 PCR 扩增片段克隆
2.2.4 重组质粒鉴定
2.2.5 鸡IFN-γ基因重组表达载体构建
2.2.6 重组表达质粒鉴定
2.2.7 重组鸡IFN-γ在大肠杆菌表达系统中诱导表达
2.2.8 融合蛋白纯化
2.2.9 免疫印记分析
2.2.10 重组蛋白对VSV 感染细胞细胞病变的抑制
2.2.11 多克隆抗体制备
2.2.12 多克隆抗体鉴定
2.2.13 重组鸡γ干扰素对禽流感灭活苗的免疫增强效应
2.3 数据处理
3 试验结果
3.1 鸡 IFN-γ 基因克隆与序列测定
3.1.1 鸡脾淋巴细胞总RNA 分离
3.1.2 RT-PCR 法扩增鸡IFN-γ基因序列
3.1.3 重组质粒pMD18-T-ChIFN-γ的鉴定
3.1.4 ChIFN-γ序列测定及分析
3.2 鸡 IFN-γ 基因在大肠杆菌中的表达及多克隆抗体制备
3.2.1 重组表达质粒鉴定
3.2.2 融合蛋白表达、鉴定与纯化
3.2.3 重组蛋白生物活性检测
3.2.4 多抗血清效价及特异性鉴定
3.3 禽流感HI 抗体水平测定
3.4 雏鸡免疫器官及血液T、B 淋巴细胞增殖功能动态变化
3.4.1 雏鸡胸腺T 淋巴细胞增殖功能动态变化
3.4.2 雏鸡脾脏T 淋巴细胞增殖功能动态变化
3.4.3 雏鸡血液T 淋巴细胞增殖功能动态变化
3.4.4 雏鸡脾脏B 淋巴细胞增殖功能动态变化
3.4.5 雏鸡血液B 淋巴细胞增殖功能动态变化
3.5 雏鸡免疫器官及血液不同亚型T 淋巴细胞数量动态变化
3.5.1 雏鸡免疫器官及血液CD4+ T 淋巴细胞动态变化
3.5.2 雏鸡免疫器官及血液CD8+ T 淋巴细胞动态变化
3.6 雏鸡体重增长测定
3.7 免疫器官指数测定
3.8 禽流感病毒感染雏鸡病理学观察
3.9 免疫攻毒保护率
4 讨论
4.1 鸡 IFN-γ 基因克隆与表达
4.1.1 鸡IFN-γ基因克隆与序列
4.1.2 鸡IFN-γ基因表达、纯化与生物活性
4.1.3 多克隆抗体制备及鉴定
4.2 ChIFN-γ 对禽流感灭活苗免疫增强效应
4.2.1 雏鸡免疫后HI 抗体水平变化
4.2.2 雏鸡免疫后T、B 淋巴细胞增殖功能变化
4.2.3 雏鸡免疫后不同亚型T 细胞数量动态变化
4.2.4 雏鸡增重及免疫器官指数变化
4.2.5 禽流感病毒攻击雏鸡病理学变化及免疫保护率
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
本文编号：3844559
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/rengongzhinen/3844559.html