不同生长速率黑杨的基因表达谱及黑杨CYCD基因的功能鉴定

发布时间：2016-08-08 20:15

  本文关键词：六个杨树无性系苗木生长、生物量和光合作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

《北京林业大学》 2011年

不同生长速率黑杨的基因表达谱及黑杨CYCD基因的功能鉴定

郝爽  

【摘要】：杨树具有极强的速生性,然而目前关于该特性分子机制的研究较为有限。本研究以两种生长速率不同的黑杨NE19(P.nigra×(P.deltoides×P. nigra))和DN2(P.deltoides×P.nigra)为研究材料,通过Affymetrix杨树表达谱芯片比较了两种黑杨从速生前期至速生期基因表达谱的变化。通过对两种黑杨在不同生长发育阶段的芯片结果进行分析,共筛选出1695个差异表达的基因(two-way ANOVA, p0.01; fold change≥2)。NE19和DN2除了含有共同变化的基因,还有只在其中一个品系中表达量特异性上调或下调的基因。通过对这些差异表达的基因进行功能分析,结果表明两种黑杨品系为适应各自的速生期采取了不同的生物学策略。生长速率较快的NE19具有更强的光合能力和更大的总叶面积,在速生期侧重与生长相关的初生代谢。然而生长速率较慢的DN2有更多特异性上调的基因参与防御相关的次生代谢和胁迫响应。杨树的速生性与细胞周期调控过程密切相关,而CYCD在调控细胞周期G1到S期的转换中起重要作用。同时芯片结果显示D型细胞周期蛋白(CYCD3;1)基因在NE19整个生长期内的表达量都高于DN2。为进一步研究杨树中不同CYCD基因家族的功能,探究其与杨树速生的关系,本研究从黑杨中克隆出六个CYCD基因,并将其转化至酵母G1期细胞周期蛋白突变体进行功能鉴定。通过对黑杨组培苗进行糖和植物激素处理,观察到黑杨根部形态发生改变,同时用实时荧光定量PCR技术检测了该处理条件下CYCD基因表达量的变化。结果表明,不同黑杨CYCD家族基因在树木生长发育过程中所起的作用可能存在差异。

【关键词】：
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：S792.11
【目录】：

摘要3-4

ABSTRACT4-9

1 引言9-19

1.1 杨树速生机理研究9-15

1.1.1 杨树生长规律9-10

1.1.2 杨树速生机理的研究进展10-12

1.1.3 杨树生长与细胞周期调控12-15

1.1.3.1 植物细胞周期过程12

1.1.3.2 植物细胞周期调控因子12-14

1.1.3.3 植物细胞周期的关键调控点14-15

1.2 基因芯片技术研究基因的表达15-17

1.2.1 基因芯片原理15-16

1.2.2 基因芯片技术16

1.2.2.1 芯片的制备16

1.2.2.2 靶样品的准备16

1.2.2.3 杂交反应16

1.2.2.4 信号检测和分析16

1.2.3 基因芯片在杨树研究中的应用16-17

1.3 研究目的及意义17-19

1.3.1 目的及意义17-18

1.3.2 技术路线18-19

2 不同生长速率黑杨的生长及生理指标监测19-22

2.1 材料与方法19

2.1.1 实验材料19

2.1.2 生长及生理指标测定19

2.1.2.1 株高和地径的测量19

2.1.2.2 光合指标的测定19

2.1.2.3 总叶面积的测定19

2.2 结果19-21

2.2.1 NE19和DN2株高和地径的比较19-20

2.2.2 NE19和DN2净光合速率和总叶而积的比较20-21

2.3 讨论21-22

3. 芯片杂交和数据分析22-41

3.1 材料与方法22-27

3.1.1 实验材料22

3.1.2 黑杨总RNA的提取22-24

3.1.2.1 实验器皿和耗材的处理23

3.1.2.2 所需药品23

3.1.2.3 RNA提取步骤23-24

3.1.3 基因芯片流程24

3.1.3.1 cDNA的合成和纯化24

3.1.3.2 生物素标记cRNA的合成、纯化和定量24

3.1.3.3 cRNA的片段化24

3.1.3.4 基因芯片杂交24

3.1.3.5 探针阵列的洗脱与染色24

3.1.3.6 芯片扫描24

3.1.4 芯片数据的处理与分析24-26

3.1.4.1 芯片数据的获取和标准化处理25

3.1.4.2 差异表达基因的筛选25

3.1.4.3 探针信息的注释25

3.1.4.4 主成分分析25

3.1.4.5 层级聚类分析25-26

3.1.4.6 差异表达基因的功能注释26

3.1.5 芯片结果的实时荧光定量PCR验证26-27

3.1.5.1 cDNA的合成26

3.1.5.2 实时荧光定量PCR26-27

3.2 结果27-35

3.2.1 黑杨总RNA的质量27-28

3.2.2 NE19和DN2在速生前期和速生期差异表达的基因28-30

3.2.2.1 差异表达的基因28

3.2.2.2 差异表达基因的主成分分析28-29

3.2.2.3 差异表达基因的层级聚类分析29-30

3.2.3 基因芯片结果的实时荧光定量PCR验证30

3.2.4 差异表达的转录因子30-32

3.2.5 在生长速率快的杨树品系中特异性上调的基因32-33

3.2.6 在生长速率慢的杨树品系中特异性上调的基因33-34

3.2.7 NE19和DN2中共同上调和下调的基因34-35

3.3 讨论35-39

3.3.1 光合作用35

3.3.2 碳水化合物和氮的利用35-37

3.3.3 细胞分裂、生长和分化37

3.3.4 次生代谢过程37-39

3.3.5 激素和胁迫相关基因39

3.4 结论39-41

4. 杨树CYCD基因的功能鉴定及其对糖和植物激素的响应41-52

4.1 材料和方法41-45

4.1.1 实验材料41

4.1.2 黑杨材料的糖和植物激素处理41

4.1.3 RNA的提取和反转录41

4.1.5 杨树CYCD基因家族成员的克隆41-43

4.1.5.1 PCR扩增杨树CYCD基因家族成员41-42

4.1.5.2 目的片段的回收和纯化42

4.1.5.3 目的片段与T载体连接42-43

4.1.5.4 目的基因转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞43

4.1.5.5 重组质粒的鉴定和测序43

4.1.5.6 测序成功菌液的质粒提取43

4.1.6 顺式作用原件的鉴定43

4.1.7 实时荧光定量PCR检测杨树根中CYCD基因家族成员的表达43

4.1.8 酵母转化43-45

4.1.8.1 酵母表达载体的构建43-44

4.1.8.2 重组质粒转化酵母44-45

4.1.9 酵母生长曲线测定45

4.2 结果45-49

4.2.1 黑杨CYCD基因家族成员的克隆和序列分析45

4.2.2 杨树CYCD基因启动子中响应激素的顺式作用元件45-46

4.2.3 PdCYCD1-7对酵母G1期细胞周期蛋白突变体转化46-47

4.2.4 蔗糖和植物激素处理后黑杨根部的形态学特征47-48

4.2.5 黑杨CYCD基因成员在蔗糖和激素处理条件下的表达谱分析48-49

4.3 讨论49-52

5 结论与展望52-54

5.1 结论52

5.2 创新点52-53

5.3 展望53-54

参考文献54-63

缩略词表63-64

攻读硕士学位期间发表论文64-65

个人简介65-66

导师简介66-67

致谢67

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