扁桃酸代谢对隐球菌毒力作用的探讨及头癖常见病原菌的快速分子鉴定

发布时间：2017-05-02 15:11

  本文关键词：扁桃酸代谢对隐球菌毒力作用的探讨及头癖常见病原菌的快速分子鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：选题背景隐球菌病是临床上最常见的侵袭性真菌病之一,在全球范围内存在很高的发病率和致死率。随着科学研究的进一步深入,目前隐球菌已经作为一种模式真菌广泛的应用于致病机制、毒力因子、临床药敏、分子遗传学及生理特性等方面的研究。目前研究较为透彻的毒力因子主要包括：隐球菌荚膜、黑色素的分泌、高温高渗生长及尿素酶的产生等。通过前期研究“新生隐球菌减数分裂基因ISC10的生理功能”中发现,减数分裂基因ISC1O突变株的毒力明显降低,在肺部和脑部的荷菌量减少的同时,通过基因芯片分析基因组学变化发现引起了酪氨酸代谢相关调控的改变,尤其是扁桃酸代谢相关蛋白基因表达的上调,使得扁桃酸盐产生增加。然而,扁桃酸及其代谢在真菌方面目前尚未有所研究,主要局限在抗寄生虫、抗阴道滴虫及工业化学光学异构性的合成方面,而扁桃酸衍生物作为临床医药的重要中间体,参与介导心血管系统及泌尿系统感染等。由此我们试图初步探讨研究扁桃酸及其代谢对于隐球菌毒力方面发挥的作用,为筛选隐球菌新的毒力因子及后期寻找新的临床治疗靶点提供新的依据。头癣是我国常见的浅部真菌病,主要累及儿童,具有很强的传染性及传播性。在世界范围内,其致病菌呈现出明显的地域性差异。而在我国,尤其在新疆西部地区多以紫色毛癣菌为主,而大陆的其他地区则为表现为犬小孢子菌。随着我国经济的迅猛发展,卫生体制改革的进一步深化,人们的生活水平在不断提高,卫生观念意识得到了不断地加强,我国大陆东南部地区头癣的发病率明显降低,多表现为散发。但在新疆地区,一直以来,病例仍居高不下。因此,我们希望能够从整体水平上将各个中心相关报道进行汇总,并进一步分析、总结我国近年来头癣的发病情况,从而掌握主要致病菌及其流行病学特点则更具有深远的意义。在临床病原菌的诊断方面,传统大多采用直接镜检法、菌种培养法及生理生化法等。往往存在耗时长,主观依赖性较强,易误诊,影响因素较多,易污染等问题；随着PCR等分子生物学手段的推广,结合一、二代测序,大大提高了诊断的准确性,但是操作需要昂贵的仪器设备和专业的技术支持,存在严格的条件的局限性,难以在临床上得到普遍的推广与应用。同时鉴于皮肤癣菌菌落表型多样性和遗传进化的相近性,利用常规ITS PCR法难以将其鉴定区分至种。因而,在临床上,寻求一种新的简单、便捷,且具有高度敏感性和特异性的检测方法,不仅对早期的疾病诊治及预后都具有重大的现实意义,而且为其他病原菌及相关疾病的诊治提供了新思路,以供借鉴。研究目的1.构建新型隐球菌扁桃酸消旋酶(mandelate racemase, MRE)、过氧化氢铜胺氧化酶(peroxisomal copper amine oxidase, PCAO)和扁桃酸脱氢酶(mandelate dehydrogenase, LMD)基因突变菌株,并初步探究其对新生隐球菌毒力表型的影响；2.通过文献统计,分析2005年1月至2014年12月期间有关头癣的文献及病例报道,汇总我国近十年来关于头癣发病情况,并针对临床类型及病原菌进行分析；3.比较MLPA.RCA两种快速分子技术鉴定头癣常见病原菌,紫色毛癣菌及犬小孢子菌及其相关菌株。研究方法第一部分：通过分析扁桃酸脱氢酶、过氧化氢铜胺氧化酶及扁桃酸消旋酶蛋白生理特性,设计基因特异性引物,利用套叠PCR的方法,构建重组基因突变框,通过基因枪导入背景菌株JEC21,经诊断性PCR及测序验证成功后,保藏菌株。同时分析突变菌株对于高温、高渗、应激、黑色素分泌、胞外荚膜等体外表型改变,为深入研究其生理机制奠下基础第二部分：通过万方及Pubmed数据库为搜索引擎以“头癣”、"tinea capitis"为关键词,进行回顾性分析,统计搜索2005年1月至2014年12月期间相关头癣文献及相关的病例报道,排除明显重复及信息不全的病例,并根据不同地区、头癣的类别分析总结其头癣流行病学发病率及主要致病菌的差异。第三部分：在本研究中,我们通过应用并比较两种等温扩增技术：滚环快速扩增法(rolling-circle amplification, RCA)和多重连接扩增技术(multiplex ligation dependent probe amplification, MLPA)鉴定紫色毛癣菌、犬小孢子菌及其相关菌株,其中包括美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)标准菌株4株、荷兰标准菌种保藏馆(Centraalbureau voor Schimmelcultures, CBS)标准菌株13株及上海市医学真菌保藏中心临床菌株60株,其中含有22株的犬小孢子菌及31株紫色毛癣菌。根据其核糖体DNA的内转录间隔区(ITS1和ITS2区域)基因序列的差异性设计特异性的探针,探针及引物在等温条件下根据碱基互补配对的原则在特定链置换酶的作用下能够产生特异性的连接匹配,从而便与检测其特异性；取等量的RCA、MLPA反应模板,将其依次进行的10倍浓度的稀释,同样的反应体系进行操作,检测其敏感性；利用试剂SYBR GreenⅠ能够与DNA双链小沟结构相结合的特点,在PCR扩增时一旦连接到DNA双链结构后,其就会释放荧光信号,而未连接到双链结构时SYBR GreenⅠ则不发射荧光,从而能够更加直观的进行检测。研究结果1.扁桃酸及其代谢对新生隐球菌毒力作用的探讨：通过了解扁桃酸代谢通路,分析其蛋白生物信息学信息,发现扁桃酸消旋酶(mandelate racemase, MRE)在D血清型JEC21隐球菌中是由438个氨基酸组成,有两个结构域,而在A血清型H99标准菌株中是由三个结构域组成,存在种间的差异性；过氧化氢铜胺氧化酶(peroxisomal copper amine oxidase, PCAO)是铜胺氧化酶家族中的一份子,同扁桃酸脱氢酶(mandelate dehydrogenase, LMD)一样,在两种血清型中存在高度的同源性。成功构建了扁桃酸消旋酶、过氧化氢铜胺氧化酶、扁桃酸脱氢酶JEC21基因缺陷菌株(mreA, pcaoA,lmd△)。并进一步研究其对于隐球菌毒力表型的影响,发现MRE作为一种消旋酶可能更多参与扁桃酸光学手性的异构性,对于功能影响上尚未有新的发现；缺陷菌株pcao△、imd△在高温、高渗、氧化应激等毒力减退,黑色素产生增加,而在有性生殖方面,突变菌株MAT lmd△×MAT a JEC20单交配相比JEC21×JEC20菌丝和担孢子生成效率稍有下降,其具体机制有待于进一步的研究探讨。2.我国近十年头癣流行病学分析情况：通过病例回顾性统计分析,在近十年来相关头癣流行病的文献总计7828个病例,其中男性病例数3519,女性病例数4309,男女比例0.82：1,儿童多见,临床类型以白癣最为多见,共计2153例,占59.48%,脓癣、黑点癣次之；犬小孢子菌为主要的头癣致病菌,共鉴定2510株,占55.58%,紫色毛癣菌占14.81%,铁锈色小孢子菌及红色毛癣菌病例数次之。3.比较两种分子技术快速鉴定头癣常见病原菌：通过研究发现RCA法和MLPA法能够快速鉴定常见头癣致病菌,紫色毛癣菌和犬小孢子菌,且具有高度特异性和敏感性。两种快速分子鉴定法特异性均可达100%；通过10倍滴度的依次稀释,MLPA法检测紫色毛癣菌敏感度低至101copies,犬小孢子菌探针敏感度低至102copies;RCA法鉴定紫色毛癣菌敏感性为106copies,犬小孢子菌敏感度为108copies;相比较之,MLPA法更加高效,而等温扩增技术为临床的鉴定和诊断指明了新的简单易行、快速经济的新方向。研究结论1.扁桃酸及其代谢在隐球菌种间存在高度保守,通过构建基因缺陷株(mre△, pcaoA,lmd△),发现pcao△,lmd△在隐球菌毒力表型及有性生殖方面上毒力减弱；mre△可能介导扁桃酸的旋光异构性,对于隐球菌毒力表型影响不大；2.近十年来,我国头癣病情发展相对缓慢,主要感染儿童,临床类型以白癣为主,主要致病菌为犬小孢子菌和紫色毛癣菌；3.基于犬小孢子菌、紫色毛癣菌ITS序列设计的探针通过MLPA法和RCA法能够快速、高效而特异性的鉴别头癣感染；4.MLPA法相比RCA法能够更高的敏感的鉴别犬小孢子菌和紫色毛癣菌。
【关键词】：扁桃酸 隐球菌 头癣 等温扩增法 MLPA RCA
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R756.1
【目录】：

• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 中英文缩略词对照表13-14
• 前言14-17
• 第一部分 扁桃酸及其代谢对新型隐球菌毒力作用的探讨17-28
• 引言17-18
• 一、材料与方法18-21
• 二、实验结果21-26
• 三、实验讨论26-28
• 第二部分 我国近十年头癣流行病学分析28-32
• 引言28
• 一、材料与方法28-29
• 二、实验结果29-30
• 三、实验讨论30-32
• 第三部分 比较两种分子技术快速鉴定头癣常见病原菌32-54
• 引言32-33
• 一、实验材料33-39
• 二、实验方法39-46
• 三、实验结果46-51
• 四、实验讨论51-54
• 全文总结54-56
• 参考文献56-61
• 文献综述61-68
• 参考文献64-68
• 发表论文与科研工作68-69
• 致谢69

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