Peroxiredoxin-1在胃癌腹膜转移中的作用及相关机制的研究

发布时间：2017-06-01 19:17

  本文关键词：Peroxiredoxin-1在胃癌腹膜转移中的作用及相关机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【背景】胃癌是我国目前最常见恶性肿瘤之。腹膜转移是其最常见的转移形式，同时也是胃癌根治术后最常见的复发形式，是影响胃癌治疗效果的关键因素之【1-2】，也是导致胃癌患者死亡的主要原因之【3】。目前，胃癌腹膜转移的机制尚不清楚，研究表明可能与多个癌基因、抑癌基因以及氧化还原状态等有关【4】。近年来，随着胃癌根治术的开展与成熟，其局部复发率有所下降，但是其死亡率任然居于各种恶性肿瘤死亡率的前列。相关统计表明：约25%的胃癌患者在术前或者术中被诊断存在胃癌的腹膜转移，从而失去了手术治疗的最佳机会，进展期胃癌即使行胃癌根治术治疗，术后任然有大约40%-60%的患者会发生腹膜转移。因此，有必要对胃癌腹膜转移的相关因素进行深入研究以揭示其发生和发展的机制，进而有效地指导临床治疗和改善预后。 Peroxiredoxin-1(Prx-1)是新近发现的类抗氧化物酶Peroxiredoxins家族中的种。以往对Prx-1的研究主要是其在抗氧化方面的作用，表现为Prx-1对活性氧族（activated oxygen species,AOS）的清除，保护细胞免受活性氧造成的损伤。近年来的研究发现：Prx-1与多种肿瘤细胞的增殖，分化和转移等生物学行为密切相关。研究表明：Prx-1在多种肿瘤中高表达，而抑制Prx-1的表达，可导致肿瘤增殖受抑和放疗增敏作用，因此，初步推断Prx-1与肿瘤的发生、发展密切相关。但Prx-1与人类胃癌的腹膜转移是否相关目前尚不清楚。 通过比较蛋白组学对胃癌细胞系（SGC823）和腹膜高转移潜能的胃癌细胞系(SGC7901)进行比较，寻找两种细胞系之间的差异蛋白。研究发现：Prx-1为两种细胞系之间的差异蛋白之，在腹膜高转移潜能胃癌细胞系(SGC7901)中表达上调。进步通过Western blot免疫印记法和免疫组化法在细胞水平和临床标本水平进行检验，实验结果表明：较胃癌细胞系(SGC823)，腹膜高转移潜能的胃癌细胞系(SGC7901)中Prx-1的表达显著增强；胃癌腹膜转移灶与癌旁正常组织、胃癌原发灶、淋巴结转移灶两两比较，其阳性率结果有差异。因此，初步推断，Prx-1在胃癌的腹膜转移中可能发挥重要作用。 【目的】 1、应用比较蛋白组学寻找胃癌细胞系(SGC823)和腹膜高转移潜能胃癌细胞系(SGC7901)之间的差异性蛋白。 2、检验胃癌细胞系（SGC823）和腹膜高转移潜能胃癌细胞系(SGC7901)中Prx-1的表达情况。 3、研究Prx-1在人类胃癌腹膜转移灶中的表达情况，，比较Prx-1在胃癌原发灶，胃癌腹膜转移灶，淋巴结转移灶及癌旁正常胃黏膜组织中的表达情况，探究Prx-1在人类胃癌腹膜转移中的机制及其与患者病理参数之间的关系。 【方法】 1、细胞总蛋白的制备和双向电泳： 胃癌细胞系(BGC823)和腹膜高转移潜能胃癌细胞系(SGC7901)在温度37℃、CO2浓度5%的培养箱中培养48小时，取对数生长期细胞制备总蛋白；用Bradford法检测蛋白质浓度；用提取400ug细胞总蛋白行双向电泳；用24cm、PH值为4-7、固相PH梯度（IPG）胶条泡胀上样。 2.电泳凝胶图像分析： 银染后的电泳凝胶采用ImageScanner图像扫描仪和Imagemaster图像分析软件进行扫描和分析。同等条件下，对两个细胞系的总蛋白样品进行3次双向电泳和图像分析，在同种细胞系的蛋白质电泳图谱中挑选蛋白质点清晰的图像作为参照，与另外两次的电泳图像进行匹配。最后将3次电泳所得的蛋白质点图谱在Imagemaster软件中创建平均胶。以（BGC823）细胞系的平均胶为参照胶与（SGC7901）细胞系的平均胶行两两匹配比较。以蛋白质表达水平（相对体积）增加2倍及2倍以上作为差异点，并把这些点从凝胶中切割下来进步分析。 3、蛋白质质谱分析： 取双向电泳凝胶上表达差异的蛋白质点凝胶块进行胶内酶切，并提取肽段。取α-氰基-4-基肉桂酸（α-CHCA）5mg/ml的基质溶解液0.5ul加入到金属样品板点样孔内，然后加入含有0.1%三氟乙酸（TFA）的水-乙腈混合液0.5ul溶解肽段提取物。在室温下干燥样本。用基质辅助激光解析离子化飞行时间串联质谱仪4700型分析肽质量指纹图谱和串联质谱（MS/MS）。每个点样孔每种光谱激光发射500次，收集相对分子质量/电荷比值（质荷比）为800-3200的峰谱。然后选取定数量的肽段进行碰撞诱导解离（CID）串联质谱分析，激光频率为200Hz。 4、Western blot蛋白印迹（1）： 将准备好的细胞用4℃预冷PBS液洗涤，重复3次，将PBS弃尽。每瓶细胞加入400μ l含PMSF的裂解液，在冰上裂解30分钟。裂解完成后，用刮棒将细胞刮于培养瓶侧，用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管内。离心后提取上清，Bradford法蛋白定量。样品上样于12％PAGE—SDS电泳后转至NC膜上。加入抗室温杂交3小时后加入HRP标记的二抗作用，最后加入荧光剂暗室曝光显影。 5、采用免疫组化SP法： 4μ m石蜡切片，常规脱蜡至水，PBS（PH7.4）洗涤3次，高压锅内煮沸8分钟修复抗原；3%H2O2孵育10分钟以消除内源性过氧化物酶活性。正常山羊血清封闭非特异性抗原10分钟，倾去血清，滴加Prx-1单抗，4℃条件下放置过夜。滴加二抗室温孵育30分钟，PBS洗涤3次，DAB显色；苏木精复染；中性树脂封片。 7、数据分析： 应用GPS Explore软件处理肽质量指纹图谱和串联质谱数据，在搜索引擎（Http://www.matrixscience.com）上进行数据解析，使用的数据库为NCBInr蛋白质数据库。搜索条件如下：数据分析类型为MS联合MS/MS；搜索物种为人；肽质量偏差范围为2000；串联质谱偏差范围为4000。对数据库搜索的结果根据蛋白评分、总离子评分、序列覆盖率及直接测序等进行综合评价，从而鉴定出蛋白质（每个差异表达蛋白质点鉴定出个蛋白质），并计算出可信度。 【结果】 1、双向凝胶电泳分析和质谱分析鉴定结果：通过2-DE PAGE分离技术发现，(BGC823)图谱平均检测到(1130+60)个蛋白点，(SGC7901)图谱平均检测到(1030+53)个蛋白点。进行两组问的匹配分析，筛选出大于或等于两例以上的显著差异点有30个。使用Mascot软件搜索NCBI蛋白质序列数据库后，进行综合分析，共成功鉴定出20个有意义的蛋白质。11个蛋白仅在SCG7901细胞株表达明显增高，同时我们发现9个蛋白仅BGC823中高表达，其中Prx-1在SCG7901中表达增高。 2、Western blot蛋白印迹研究结果表明，胃癌细胞系（BGC823）和腹膜高转移潜能细胞系（SGC7901）中Prx-1的表达呈差异性，Prx-1在(SCG7901）中表达明显增高，覆盖率达64%。 3、免疫组化结果显示:胃癌原发灶，腹膜转移灶，淋巴结转移灶和癌旁正常胃黏膜组织中Prx-1的阳性率比较，差异有统计学意义，总的卡方值为61.038，(P0.01);腹膜，转移灶和胃癌原发灶，淋巴结转移灶，癌旁正常胃黏膜行两两比较，应用卡方分割法，差异有统计学意义(P0.017)。 【结论】： 我们的研究结果表明Prx-1与胃癌的腹膜转移可能相关，Prx-l可能是胃癌腹膜转移的个分子标记物和预后指标，但是其内在机理尚需进步研究。
【关键词】：胃癌 胃癌腹膜转移 Prx-1
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 中英文缩略词5-6
• 摘要6-10
• Abstract10-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-20
• 结果20-24
• 讨论24-27
• 参考文献27-29
• 综述29-34
• 综述参考文献32-34
• 致谢34-35
• 个人简历35

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 曾跃平;刘洁;王宝玺;;过氧化物酶Peroxiredoxin家族与肿瘤关系研究进展[J];癌症进展;2010年02期

2 章波,向渝梅,白云;抗氧化蛋白Peroxiredoxin家族研究进展[J];生理科学进展;2004年04期

3 李正荣;詹文华;;胃癌腹膜转移的治疗进展[J];中华胃肠外科杂志;2006年05期

  本文关键词：Peroxiredoxin-1在胃癌腹膜转移中的作用及相关机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：413306