松枯梢病拮抗细菌的筛选及其抗病机制初探

发布时间：2020-07-27 15:51

【摘要】：松枯梢病是一种由松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea)引起的世界性松树病害,其广泛分布于五大洲30多个国家和地区。该病害危害树种多、发生面积大、发展迅速,造成的损失不亚于松材线虫病造成的损失。改善营林措施和使用化学药剂是现阶段防治松枯梢病的主要方式,但两者都存在不足。生物防治已经成为国内外植物病害防治的重要手段和发展方向,很多从植物体内与植物根际土壤中筛选出的微生物能有效防治病虫害,并且对植物有促生作用。本文以松球壳孢菌为指示菌,从感病松林健壮湿地松茎段中分离筛选出具有良好拮抗效果的内生细菌JK-AH7,先后对其进行了种属鉴定、抗松枯梢病机制探讨、松树体内定殖状况验证以及代谢产物发酵优化,并与其他有益菌株一并开展了野外应用试验。主要研究结果如下:从健壮湿地松茎段共分离出11株内生细菌,以松球壳孢菌为指示菌,按照生长较快、抑菌能力强及抑菌持续力久等标准筛选得到菌株JK-AH7,其对拟茎点霉、棕榈疫霉等十二种病原真菌均具有拮抗能力。经过形态观察、生理生化、16s rDNA序列比对以及特异性引物扩增,确定菌株JK-AH7为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。通过在拮抗作用下对病原菌菌丝生长、孢子萌发和不同浓度发酵产物抑菌率的观察统计,以及自身产抑菌物质能力和诱导湿地松抗病效果酶活的测定,从而对菌株JK-AH7抗病机制进行探究。结果显示,菌株JK-AH7能使病原菌菌丝产生顶端膨大、分支增加、扭曲变形等现象;能够抑制松球壳孢菌孢子萌发;发酵产物10%浓度添加量对松球壳孢菌抑制率达到89.7%;能够分泌纤维素酶、磷酸酯酶和蛋白酶等,具有一定的解有机磷能力;在接种松球壳孢菌后,经过菌株JK-AH7处理的湿地松防御酶SOD、POD、PPO活性得到增强,而抗病物质MDA、Pro含量则保持较低水平,表明了菌株JK-AH7能够增强湿地松抗松枯梢病能力,可作为一种防治松枯梢病的候选生防菌株。采用GFP标记方法和扫描电镜观察对JK-AH7菌株在松树体内定殖进行验证。激光共聚焦结果表明,在施菌30d后,在湿地松根系能够检测到标记菌株。扫描电镜对松树无菌苗施加菌株JK-AH7培养40d后的观察结果表明,JK-AH7能够在湿地松茎段进行定殖。两种验证结果说明JK-AH7菌株能在松树体内良好的定殖并且存续时间较长,表明JK-AH7菌株为内生细菌,具有生防潜能。为提高菌株JK-AH7菌体量与发酵代谢产物抑菌能力,通过单因素法、Plackett-Burman试验设计、Box-Behnken中心组合设计及响应面法对发酵培养基成分和发酵条件进行优化。优化后的培养基成分和发酵条件为:麦芽糖3g/L,胰化蛋白胨20g/L,硫酸镁12g/L,初始pH=6,培养时间60h,培养温度28℃,接种量6%,装液量80mL,转速200rpm,为后续获得具有抑菌能力的发酵代谢产物提供技术支持。在白马基地与老嘉山林场,对菌株JK-AH7与其他几株促生抗病菌株,采用施菌方式复合、浓度配比、菌株复配等进行野外应用试验。在白马实验基地和老嘉山林场部队试验区,对一年生黑松、马尾松、湿地松蘸浆施菌处理,JZ-GX1对马尾松和湿地松促生效果显著,第二年对黑松、马尾松、湿地松复施后,除FZB42对马尾松作用效果不明显外,NSM-05、JW-JS1、JZ-GX1、JK-JS7均有促生效果;在老嘉山林场汪家坝试验区,不同浓度菌株对三年生湿地松喷雾处理后,两年监测结果显示,除100mL/株NSM-05菌株外,各浓度NSM-05、JK-JS7以及NSM-05+JK-JS7均有不同程度促生效应;不同施菌方式对三年生湿地松施菌后,两年监测结果表明,菌株NSM-05采用喷雾处理促生效果更好,JK-JS7+NSM-05采用灌根或者注干效果较好,但与单施菌株差异不明显;在老嘉山林场老场部东试验区,采用灌根与喷雾复合施菌方式对三年生湿地松进行施菌处理,FZB42+JK-AH7、FZB42+NSM-05与JZ-GX1+NSM-05促生效果明显,对松枯梢病的防效上,JZ-GX1+JK-AH7、FZB42+JK-JS7、FZB42+JK-SH007、FZB42+NSM-05表现良好;对老嘉山林场余湾湿地松两年监测表明,JZ-GX1、JW-JS1、FZB42、NSM-05、NSM-05+JZ-GX1、NSM-05+JW-JS1均具有较好较持续的促生效果,各处理对株高和地径促生各有侧重。
【学位授予单位】：南京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S763
【图文】：

命名为 JK-AH7(图2-1)。培养 2d 培养 40d图 2-1 拮抗细菌对松球壳孢菌的抑制效果Fig.2-1 Inhibitory effect of antagonistic bacteria on Sphaeropsis sapinea3.2 拮抗菌株复筛及其抑菌谱将上述初筛菌株 JK-AH7 与本实验室原有的拮抗菌株 NSM-05、JK-SH007、JK-JS7 同时进行平皿拮抗比较试验，复筛试验结果表明(图 2-2)，JK-AH7 菌株的抑菌能力较强，对松球壳孢菌的抑菌能力稍弱于 JK-SH007，强于 NSM-05 及 JK-JS7，是一株有良好拮抗效果的生防候选菌株。

itory ability of JK-AH7 and JK-SH007,Sphaeropsis sapinea疫霉等十二种病原真菌作抑菌谱的拮抗效果(如表 2-1 所示)，对胶表 2-1 JK-AH7 抑菌谱1Antimicrobial spectrum of strain JK-A病原菌 抑菌能力茎点霉 ++榈疫霉 +轮斑病菌 ++纹叶枯病菌 ++链格孢 ++黄壳囊孢 ++椒疫霉 ++

G 辣椒疫霉 H 拟盘多毛孢 I 交链孢 J 胶胞炭疽 K 壳梭孢 L 松脂溃疡病菌图 2-3 拮抗细菌对 12 种病原真菌的抑制效果Fig.2-3 Inhibitory effect of antagonistic bacteria on 12 pathogenic fungi3 JK-AH7 菌株的种属鉴定3.1 形态观察与染色结果如图 2-4 所示，在 NA 平板上培养 24h 后，JK-AH7 菌株的菌落呈现白色，半透明，光湿润的菌落，稍隆起，圆形齐整，具有粘性。革兰氏染色结果表明，JK-AH7 在显微镜呈现蓝紫色，为革兰氏阳性菌。芽孢染色结果表明，拮抗细菌两端被染成黑色，中间出中空透明，则表明 JK-AH7 能产生芽孢，为芽孢杆菌且为中生芽孢。

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3 刘秀]

本文编号：2772045