为建立高效的农杆菌介导木质部特异启动子JCes AP系列缺失片段的遗传转化系统,本试验以烟草和三倍体毛白杨无菌苗为试验材料,通过农杆菌介导法将前期构建的融合杨树木质部特异启动子缺失片段的植物表达载体转入烟草和杨树。对获得的抗性植株进行PCR检测和报告基因活性分析,从而检测转化效果。主要结果如下:(1)在烟草遗传转化过程中,确立了适宜的菌液浓度为OD600≈0.4~0.6,一般侵染时间为8~10min,共培养2d为宜。最佳分化培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA,头孢噻肟钠的抑菌浓度为50mg/L,卡那霉素生根筛选过程中的适宜浓度为20mg/L,潮霉素生根筛选浓度为5mg/L。(2)采用注射法进行烟草瞬时转化,对烟草叶片进行GUS染色(p BI121)和GFP绿色荧光检测(p CAMBIA1302),结果表明携带不同缺失片段与GUS报告基因的转基因植物在不同部位均可以观察到蓝色;携带不同缺失片段与GFP报告基因的转基因植物在不同部位均可以观察到绿色荧光。说明启动子系列缺失片段均具有启动子活性。利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法,将融合启动子缺失片段的p BI121和p CAMBIA1302植物表达载体转化烟草。经过PCR检测和报告基因活性检测分析,结果表明不同目的基因已经整合到了烟草基因组中,获得稳定表达的转基因植株共24株,转化率达27%。(3)在毛白杨遗传转化过程中确定了菌液最佳侵染时间为3min,最适合的菌液浓度为OD600≈0.4,建立了最佳分化培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA,在筛选和生根过程中头孢噻肟钠的抑菌浓度为50mg/L,卡那霉素的适宜浓度为20mg/L。(4)采用瞬时转化方法对杨树叶片进行GUS染色,结果表明携带不同缺失片段的与GUS报告基因的转基因植物在相应部位均可以观察到蓝色,说明启动子系列缺失片段均具有启动子活性。利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法,将融合启动子缺失片段的p BI121植物表达载体对杨树进行遗传转化。经过PCR分子检测和GUS染色,结果表明ZU2、ZU3、ZU4、L2缺失片段已转入杨树,L3、L4基因获得的植株为假阳性植株,未转化到杨树中。共获得稳定表达的转基因植株17株,转化率达53%。
【学位单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2;S792.11
【参考文献】
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2822732
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