辣木两种新病害病原生物学及其室内药剂筛选

发布时间：2020-11-10 20:59

　　 辣木(Moringa oleifera)原产印度及非洲,为多用途的经济树种,辣木属单科单属植物,是多年生常绿乔木或多年生热带落叶乔木。人们开发和利用辣木作为营养食物、药物及其它功能原料,现在已广泛分布于非洲、亚洲和中美洲的30多个热带、亚热带国家或地区,有良好的开发利用前景。近年来其栽培面积在我国不断扩大,然而因栽培技术落后、管理粗放加上气候影响等,辣木栽培过程中深受病虫害威胁,目前已报道病害中主要有半裸镰刀菌(Fusarium semitectum)和黑星菌(Fusicladium pallidorseum)侵染果荚和茎部。辣木枝枯病、辣木叶斑病是2015年11月在海南省昌江辣木种植基地被发现,目前尚未见报道。本试验对该两种病害进行病原菌鉴定、生物学特性测定、化学药剂筛选,并用绿色荧光蛋白(GFP)标记辣木叶斑病菌,目的是为这两种病害进行早期诊断、预测预报及田间防治提供理论基础。主要研究结果:1.明确鉴定了辣木上两种新病害:采用组织分离法、柯赫氏法则验证、形态学特征观察和rDNA-ITS序列分析等方法,鉴定了辣木枝枯病病原为木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)、辣木叶斑病病原为多主棒孢(Carynespora cassicola)。2.生物学特性:木贼镰刀菌(F.equiseti)生长适宜温度25～30℃,最适温度28℃;适宜pH 6～8,最适pH为7;在PDA和PSA培养基上菌丝生长最快且密集,最适合该菌生长;光照对该菌菌丝生长影响不大,无显著差异;以蔗糖为碳源时利用率最高,菌丝生长最快;以牛肉浸膏为氮源时利用率最高,菌丝生长最快;致死温度为65℃,10min。多主棒孢(C.cassiicola)的生长适宜pH6～8,最适pH为7;在PDA培养基上生长,最适合该菌生长;以蔗糖和木糖的碳源时菌丝生长较快;以牛肉浸膏和蛋白胨为氮源时菌丝生长较快;光照对该菌菌丝生长影响不大,无显著差异;适宜温度25～30℃,最适温度28℃;致死温度为60℃,10min。3. GFP标记了C.cassiicola:将C.cassiicola通过PEG介导原生质体转化的方法,获得在菌丝、分生孢子稳定发出绿色荧光的转化子,将所得转化子的形态特征与野生菌相比,生长速度比野生菌慢,菌落形态无明显差异,致病性测定与野生菌相比致病能力未减弱。4.药剂筛选:选用10种药剂,分别测定对两种病原菌的毒力。对F.equiseti,毒力最强的杀菌剂是丙环唑,EC50最小为0.167μg/mL、EC90为3.951μg/mL,氟硅唑、咪鲜胺、戊唑醇、腈菌唑、苯醚甲环唑EC50分别为0.39、1.409、1.411、7.271、8.561μg/mL,对Fequiseti的抑制效果相对较好;代森锰锌、甲基硫菌灵和百菌清,EC50分别为18.921、32.594、76.764 μg/mL抑制效果相对较差;异菌脲的EC50为90.59 μg/mL毒力最弱。对 C.cassiicola 氟硅唑的 EC50为 0.184 μg/mL,EC90为 160.4 μg/mL,甲基硫菌灵的EC50为3.335 μg/mL,EC90为50.808 μg/mL,从EC50和EC90综合考虑结果是甲基硫菌灵的毒力最高,氟硅唑次之,以及丙环唑、咪鲜胺、戊唑醇和代森锰锌EC50 分别为 6.382、8.154、13.649、26.716 μg/mL 对 C cassiicola 的抑制效果相对较好;腈菌唑、异菌脲、苯醚甲环唑则抑制效果相对较差,EC50分别为30.852、31.13、36.181 μg/mL;百菌清EC50为269.497 μg/mL毒力最弱,抑菌效果最差。
【学位单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S763.7
【部分图文】：

其中由１８Ｓ、５．化和２８ＳＨ者基因姐成一个高度保守的转录单元（燕勇等，??２００８），灯Ｓ区域被５．化ｒＤＮＡ分隔为ＩＴＳ１?（位于１８Ｓ和５．８Ｓ之间）和打Ｓ２?（位于??５．化和２化之间）两个片断（王源超等，２０００）（如图１）。??ｒｍ的面分?ＩＴＳ２的价巧??２８Ｓ?ｒＤＮＡ?—３Ｈ??—＾?中麵■??ｆＴＳ３?ｐｒｉｍｅｒ?ＩＴＳ＂！的ｉｔｋｉ??图１真苗ｒＤＮＡ转录区及相关引物（引用自藏勇笔２００８）??Ｆｉｇ?１?Ｆｕｎｇａｌ?ｒＤＮＡ?化ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ｒｅｇｉｏｎ?ａｎｄ?ｒｅｌａ化ｄ?ｐｒｉｍｅｒｓ??ＩＴＳ片段为非编码区所受到的选择皮力小且进化速率较快，在绝大多数的真核??生物中表现出了极为广泛的序列多态性，ＩＴＳ?１和ＩＴＳ２的保守性基本上表现为种内相??对一致，种间差异比较明显（匡治州等，２００４）。这种特点使ＩＴＳ适合于对真菌物种??进行分子鉴定，将真菌鉴定到属及属Ｗ上的种、亚种、变种，甚至菌株的水平（如表??３）?〇??表３真茵ｒＤＮＡ序列分析方法的应用范围（引用自张志华等，２００６）??Ｔａｂｌｅ?３?Ｔｈｅ?ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ?ｒａｎｇｅ?ｏｆ?ｆｕｎｇａｌ?ｒＤＮＡ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ａｎａｌｙｓｉｓ??列类巧分类范围?其菌类稱???巧Ｓ?ｒＤＮＡ

图２?ｐＣＴ７４质粒结构图（由美国Ｏｒ巧ｏｎ大学Ｃｉｕｆｆｅ扣巧壬■惠赠）??Ｆｉｇ．?２?ｐＣＴ７４?ｐｌａｓｍｉｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??供试植株??印度改良辣木唯ａ?ｏ／ｅ矿ｅｒａ?ＰＫＭｌ，实验室内常规管理，回接备用。??供试培养基??供试培养基均参考文献（方中达，１９９８）制备。??马铃薑葡萄糖琼脂（Ｐｏｔａｔｏ?ｄｅｘｔｒｏｓｅ?ａｇａｒ，?ＰＤＡ）培养基；马铃善２００?ｇ、葡萄、琼脂粉２０?ｇ、蒸溜水Ｉ以??ＰＤ培养液：是阳Ａ培养基配方中不加琼脂粉配制而成；??ＬＢ培养基：膜蛋白腺１０?ｇ，酵母提取物５?ｇ，ＮａＣｌ?１０?ｇ，蒸馈水１０００?ｍＬ，ｐＨ?７．４马铃著庶糖琼脂（Ｐｏｔａｔｏ?ｓｕｇａｒ?ａｇａｒ，?ＰＳＡ）培养基：马铃蓄２００?ｇ、庶糖２０?ｇ、??粉２０?ｇ、蒸觸水１以??查彼（Ｃｚａｐｅｋ）培养基：ＭｇＳ〇４．７也０?０．５?ｇ、Ｋ出Ｐ〇４?１?ｇ、ＫＣ１?０．５?ｇ、ＮａＮ〇３?０．？．

分离纯化后，茎部病样得到２个单菌落，菌株编号为Ｍ０１５１、Ｍ０１５７，叶片病样到３个单菌落，菌株编号为Ｍ０１１１、Ｍ０１１２、Ｍ０１１３，经过形态学观察和致病性接试验，对接种后发病的辣木枝条和叶片进行病原菌再分离鉴定，初步确定Ｍ０１和Ｍ０１１１菌株这两株菌株分别可Ｗ侵染辣木茎部和辣木叶片。且观察其发病特征Ｗ往报道的辣木病害特征存在一定差异，因此将菌株Ｍ０］?５７造成辣木茎部的病害名为辣木枝枯病，Ｍ０１１１菌株造成辣木叶片的病害命名为辣木叶斑病。??２病状描述及分离菌株致病性鉴定??２．１辣木枝巧病??辣木枝枯病病害症状主要见于辣木茎部，呈现水溃状病斑，连续的阴雨天气温条件下，ｔＫ溃状病斑不断沿枝条扩展，天晴后病部逐渐萎蕉、干缩，病部周围呈褐色，不能正常抽芽，最终枝条折断或枯死（图３－ａ）。经过柯赫氏法则回接鉴定明，Ｍ０１５７菌株接种１０?ｄ后能造成针刺接种茎干表面周围呈黄褐色，随后发病部表现出水溃状病斑，与自然发病辣木的病状相符合（图３－ｂ）；相同条件下，接种ｄ后，无伤接种的症状表现不明显（图３－Ｃ），说明分离到的菌株可Ｗ侵染枝条使发病，Ｍ０１５７是造成辣木枝枯病的病原菌。??
【参考文献】

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本文编号：2878332