橡胶树叶片蔗糖代谢关键酶的酶学和基因表达特性研究

发布时间：2023-11-26 15:42

　　天然橡胶是重要的工业原料,主要来自橡胶树。橡胶树以蔗糖为原料,在特化的乳管(细胞)中合成天然橡胶,乳管蔗糖的代谢调控是影响胶乳再生和橡胶产量的关键因素。乳管中的蔗糖来自橡胶树叶片,在橡胶生产中已发现叶片物候和发育状态直接影响胶乳产量,有关橡胶树叶片中蔗糖代谢调控的研究很少。本课题利用本实验已克隆的橡胶树中和中碱性转化酶(NIN)、液泡转化酶(VIN)、细胞壁转化酶(CWI)、蔗糖合成酶(Sus)和磷酸蔗糖合成酶(SPS)等基因家族,系统分析了它们在不同发育时期叶片样品中的表达模式,同时分析了叶片中的可溶性糖和淀粉含量,以及NIN、VIN、CWI、SPS和Sus(合成及分解方向)酶活性的变化,主要结果如下:(1)建立了用橡胶树叶片粗酶液测定NIN、VIN、CWI、SPS和Sus等蔗糖代谢关键酶酶活性的方法;(2)探索了 NIN、VIN、CWI、SPS、Sus(合成和分解方向)活性的最适pH值、最适温度、底物Km值、Vmax和酶稳定性,发现CWI可能在橡胶树叶片的蔗糖代谢调控中发挥关键作用;(3)研究了利用HPLC-ELSD测定橡胶树叶片中主要可溶性糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)含量的条件,确定...

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 天然橡胶的研究及应用现状
    1.2 橡胶树的产胶细胞(乳管)及其特化细胞器
    1.3 NR的生物合成途径
    1.4 胶乳再生
    1.5 蔗糖代谢及运输
        1.5.1 转化酶
        1.5.2 蔗糖合成酶
        1.5.3 蔗糖磷酸合成酶
    1.6 可溶性糖的测定方法分类
        1.6.1 化学法
        1.6.2 气相色谱法
        1.6.3 液相色谱法
    1.7 研究目的与意义
    1.8 本研究的技术路线
2 材料与方法
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 热研7-33-97简介
        2.1.2 实验材料
        2.1.3 质粒及菌种
        2.1.4 试剂
        2.1.5 实验仪器
    2.2 橡胶树叶片蔗糖代谢相关酶的活性测定
        2.2.1 蔗糖代谢相关酶粗酶液的提取及保存
        2.2.2 蛋白含量测定
        2.2.3 Inv及Sus分解活性的测定
        2.2.4 Sus合成活性及SPS合成活性的测定
    2.3 橡胶树叶片可溶性糖及淀粉含量的测定
        2.3.1 叶片中可溶性糖的提取
        2.3.2 叶片中可溶性糖含量测定
        2.3.3 叶片中淀粉的提取及含量测定
    2.4 橡胶树叶片蔗糖代谢关键酶基因克隆、表达分析及内参基因的筛选
        2.4.1 橡胶树不同组织RNA的提取
        2.4.2 总RNA完整性电泳检测
        2.4.3 总RNA样品中的基因组DNA的消化
        2.4.4 逆转录合成cDNA第一链
        2.4.5 橡胶树中碱性转化酶基因(NIN)、液泡转化酶基因(VIN)、细胞壁转化酶基因(CWI)、蔗糖合成酶基因(Sus)和磷酸蔗糖合成酶基因(SPS)的克隆
        2.4.6 HbNIN、HbCWI、HbVIN、HbSS和HbSPS基因荧光定量引物的筛选
        2.4.7 内参基因筛选
3 结果与分析
    3.1 橡胶树叶片蔗糖代谢相关酶的酶动力学分析
        3.1.1 蔗糖代谢酶的最适pH
        3.1.2 蔗糖代谢酶的最适温度
        3.1.3 蔗糖代谢酶的底物Km值和最大反应速率
        3.1.4 蔗糖代谢酶的稳定性
    3.2 蔗糖代谢关键酶在不同发育时期叶片中的酶活性变化
    3.3 HPLC-ELSD测可溶性糖含量的条件筛选
        3.3.1 流动相比例的优化
        3.3.2 柱温的优化
        3.3.3 氮气流速的优化
        3.3.4 漂移管温度的优化
    3.4 可溶性糖和淀粉在不同发育时期叶片中含量变化
    3.5 橡胶树不同组织RNA提取及检测
    3.6 不同发育时期叶片RNA的提取及检测
    3.7 不同发育时期叶片cDNA样品扩增检测
    3.8 叶片内参基因的筛选
    3.9 荧光定量(qPCR)引物的筛选
    3.10 蔗糖代谢关键酶基因在不同发育时期叶片中的表达模式分析
        3.10.1 HbNIN各基因在不同发育时期叶片的表达模式
        3.10.2 HbVIN各基因在不同发育时期叶片的表达模式
        3.10.3 HbCWI各基因在不同发育时期叶片的表达模式
        3.10.4 HbSPS各基因在不同发育时期叶片的表达模式
        3.10.5 HbSus各基因在不同发育时期叶片的表达模式
4 讨论
    4.1 关于蔗糖代谢关键酶酶动力学相关值的测定
    4.2 蔗糖代谢关键酶的活性和可溶性糖含量的关系
    4.3 蔗糖代谢关键酶活性和基因表达模式的关系
5 结论
参考文献
致谢
作者在读期间科研成果简介



本文编号：3868070