赤拟谷盗Ⅱ型钠离子通道基因的发现及其作为杀虫剂靶标的应用基础研究

发布时间：2020-04-16 00:53

【摘要】：昆虫钠离子通道是拟除虫菊酯类杀虫剂以及新型高效杀虫剂茚虫威和氰氟虫腙的作用靶标。基因重复是真核生物新基因起源和基因功能分化的重要途径。目前大多数昆虫基因组中只发现一个钠离子通道基因,但我们前期的研究发现赤拟谷盗基因组中钠离子通道发生基因重复,产生了 TcNavl和TcNav2两个基因。本论文在此基础上,克隆了 TcNav2的全长序列,比较了 TcNav1和TcNav2的序列同源性、系统发生、基因组结构以及选择性剪接位点,利用实时荧光定量PCR、RNA干扰等分子生物学技术分析TcNav1和TcNav2在赤拟谷盗不同组织、不同发育阶段的表达模式及其毒理学、生物学功能差异。研究结果在提高对昆虫钠离子通道功能与进化认识的同时,也为新型杀虫剂的创制提供理论依据。主要研究结果如下:克隆了赤拟谷盗Ⅱ型钠离子通道基因TcNav2全长cDNA序列,并对TcNav1和TcNav2的序列和结构特征进行了比较分析。通过反转录多聚酶链式反应技术(RT-PCR)克隆了赤拟谷盗Ⅱ型钠离子通道基因全长cDNA序列,命名为TcNav2。TcNav2开放阅读框长6114bp,编码2037个氨基酸残基。TcNavl和TcNav2氨基酸序列的一致性为86%。TcNavl和TcNav2与para氨基酸序列的一致性分别为76.1%和75.5%。系统发生分析也表明,TcNav1和TcNav2与其它昆虫钠离子通道基因聚为一支。TcNav1和TcNav2基因结构相似包括4个同源结构域(Ⅰ-Ⅳ),每个结构域含6个跨膜片段(S1-S6)。基序DEKA(功能是决定离子选择性,位于同源结构域 S5 和 S6 连接环)在 TcNav1(D387,E988,K1492,A1785)和 TcNav2(D376,E975,K1483,A1776)中高度保守。比较了赤拟谷盗钠离子通道重复基因TcNav1和TcNav2的基因组结构和选择性剪接位点。TcNav1和TcNav2基因组序列都含有26个外显子与25个内含子,对应于TcNav1基因,TcNav2基因的8号和9号外显子合并为一个外显子;对应于TcNav2基因,TcNav1基因的18号和19号外显子合并为一个外显子。TcNav1和TcNav2基因的外显子序列一致性为59.1～98.9%。TcNav1与TcNav2基因的26个外显子中,共有18个外显子长度一致,同时内含子平均长度几乎相同,分别为169bp和166bp。基因组中内含子大多符合GT-AG规则,但也有一些内含子为其他类型,例如GC-AG形式。在TcNav2基因中,对应着黑腹果蝇para的选择性剪接位点j和f,外显子1的3'端与外显子14的5'端发生外显子跳跃和选择性剪接;对应于para选择性剪接位点a和i存在于所有克隆中。内含子25发现于多个cDNA中,表明发生内含子保留。明确了赤拟谷盗钠离子重复基因在不同组织和不同发育阶段的表达量差异。用RT-qPCR检测TcNav1和TcNav2基因在不同组织和不同发育阶段的表达。结果表明,TcNav1和TcNav2基因均在头部的表达水平最高,而卵巢、胸部、中肠、马氏管和脂肪体的表达水平无显著差异。TcNav1和TcNav2基因在头部的表达有显著性差异,但在其他组织中无显著性差异。发育表达模式显示,TcNav1在1日龄幼虫的mRNA水平明显高于其他龄期阶段。各阶段TcNav1的mRNA水平均明显高于TcNav2。构建了有效的赤拟谷盗钠离子重复基因RNA干扰体系。对20日龄幼虫或1日龄蛹注射了靶向 TcNav1或 TcNav2 的特异性 siRNA(siRNA-TcNav1 和 siRNA-TcNav2)。注射后24h、48h、72h、96h、120h用qPCR检测其干扰效果。结果表明,注射24小时后,TcNav1的转录水平被显著抑制74%,而注射72小时后,TcNav2的转录水平下降了 60%。注射siRNA-TcNav1 和 siRNA-TcNav2 后 48h 和 72h 分别抑制了 70%和 86%的 TcNav1 和 TcNav2转录。此外,TcNav1-RNAi和TcNav2-RNAi对敲除其靶基因都具有高度选择性,并且由于密切相关基因的mRNA水平没有受到影响,因此没有检测到交叉干扰效应。比较了赤拟谷盗钠离子通道重复基因干扰后试虫对药剂的敏感性和对生长发育的影响。分别给20天的幼虫注射siRNA-TcNav1或siRNA-Tcav2,注射后的第1天和第3天用溴氰菊酯和高效氯氰菊酯进行生物测定,结果表明,与缓冲液处理的幼虫相比,siRNA处理的幼虫对溴氰菊酯的敏感性显著下降。注射siRNA-TcNav1或siRNA-TcNav2的20日龄幼虫化蛹明显延迟,仅观察到42%和63%的化蛹率,单独注射缓冲液的幼虫(对照组)在注射后观察到74%的化蛹。对于成虫羽化,单用缓冲液注射1日蛹后,羽化率达到90%,而注射siRNA-TcNav1或siRNA-TcNav2后,羽化率仅为75%和84%。
【图文】：

逦＾逦＾逦＾逡逑图４－１逦和及＿２基因在不同组织的相对表达量的比较逡逑所有的数据都是平均值士标准误；不同的字母表示存在显著差异（Ｐ＜邋０．０５）；邋＊＊表示极显著差异（Ｐ＜０．０１）逡逑Ｆｉｇ．４－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ＴｃＮａｖｌ邋ａｎｄ邋ＴｃＮａｖ２邋ｉｎ邋６邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋Ｔ．邋ｃａｓｔａｎｅｕｍ．ＡＷ邋ｄａｔａ邋ｗｅｒｅ逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎ士ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｄｅｖｉａｔｉｏｎ（ＳＤ）．邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｅｔｔｅｒｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ邋ａｍｏｎｇ邋ｔｈｅ逡逑ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓａｍｅ邋ｔｉｍｅ邋ｐｏｉｎｔ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ邋ｔｅｓｔ邋（Ｐ邋＜邋０．０５）．逡逑２．２邋ｒｄＶａＷ和ｒｃ〗Ｖａｖ２在赤拟谷盗不同发育阶段的表达比较逡逑通过实时荧光定量ＰＣＲ分析了邋ＴｃｉＶａＷ和ｒｃＭ？ｖ２基因在赤拟谷盗的不同发育阶段的表逡逑达情况。结果分析表明，ｒｄＶｏｖ／基因在１日幼虫的表达量最高，卵期和蛹期的表达量都逐逡逑渐上升，幼虫期和成虫期的表达量逐渐下降。１日幼虫与３日卵具有显著性差异，其余发逡逑育阶段无显著性差异。基因在５日蛹的表达量最高，，在发育阶段的表达量趋势与逡逑ｒｄｖｉ基因基本相同，各发育阶段的相对表达量无显著性差异。和ｒｃＡＴｆｌＶ２基因在逡逑不同发育阶段的相对表达量差异较大，在１日幼虫阶段，７ｙｙ0Ｗ基因的表达量是ｒｃ７Ｖａｖ２逡逑基因的６８倍，差异最少发育阶段是３日蛹期，相差十倍（详见图

Ａ逦Ｂ逡逑图５－１．赤拟谷盗钠离子通道重复基因干扰后的相对表达量（Ｌ２０）逡逑Ａ邋７ＷＶａｖ／基因干扰后的相对表达量；Ｂ邋７ｙＶｏｖ２基因干扰后的相对表达量逡逑所有数据均为平均值±标准误，＊表示差异显著（＊叩＜0．0１；邋＊＊叩＜0．00５）逡逑Ｆｉｇ．５－１．邋Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ｏｆ邋ＴｃＮａｖ邋ｇｅｎｅ邋ｉｎ邋２０－ｄａｙ－ｏｌｄ邋Ｌａｒｖａｅ邋ｏｆ邋Ｔ．邋ｃａｓｔａｎｅｕｍ．（Ａ）Ｔ＼＼ｑ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ＴｃＮａｖｌ邋ｇｅｎｅ逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ＲＮＡｉ邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ｓｉＲＮＡ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．（Ｂ）Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ＴｃＮａｖ２邋ｇｅｎｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ逡逑ＲＮＡｉ邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ｓｉＲＮＡ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．＊Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋ｂｙ邋ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡｔｅｓｔ邋（＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００５）逡逑２．１．２邋１日蛹（ＰＤ干扰效率测定逡逑选取１日蛹，进行ｓｉＲＮＡ干扰。每只蛹的注射量为４００ｎＬ，浓度ｌｎｇ／叫。选取注射后逡逑１？３天的踊，通过ＲＴ－ｑＰＣＲ检测千扰效率。结果表明，注射ｓｉＲＮＡ－：ＴｄＷ２ｄ后，ｒｃｉＶａｖ；逡逑的转录水平被显著抑制７０％。注射ｓｉＲＮＡ－７ｆｃＭＴｖ２后３ｄ显著抑制了邋８６％的７ｔＡ＾ｖ２转录。逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S379.5

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本文编号：2629196