赤拟谷盗两种细胞内钙离子通道基因的克隆及RNA干扰研究
发布时间：2024-01-20 11:47
赤拟谷盗(Tribolium castaneum)属于鞘翅目(Coleoptera)拟步甲科(Tenebrionidae)拟谷盗属(Tribolium),是一种危害严重的世界性农业粮食害虫,也是所有昆虫中系统性RNA干扰最有效的昆虫。鱼尼丁受体(Ryanodine Receptor, RyRs)和1,4,5-三磷酸肌醇受体(Inositol1,4,5-Trisphosphate Receptor, IP3Rs)均是控制Ca2+从胞内钙库释放的四聚体钙离子通道。鱼尼丁受体是新型杀虫剂氟虫酰胺和氯虫酰胺的作用靶标,1,4,5-三磷酸肌醇受体是开发新型高选择性杀虫剂的重要潜在靶标,但目前国内外有关昆虫鱼尼丁受体和1,4,5-三磷酸肌醇受体这两种细胞内钙离子通道基因结构与功能的研究还相对滞后,并且对其在昆虫生长发育过程中的作用尚无报道。本文克隆了赤拟谷盗鱼尼丁受体和1,4,5-三磷酸肌醇受体基因,分析了二者在赤拟谷盗不同发育阶段的表达模式,并在此基础上利用RNA干扰技术对其功能进行了研究。研究结果对进一步提高对昆虫细胞内钙离子通道结构和功能关系的认识以及新型高效杀虫剂的创制具有重要的理论意义和...
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1 昆虫细胞内钙离子通道研究进展
1.1 细胞内钙离子通道
1.2 鱼尼丁受体和1,4,5-三磷酸肌醇受体
1.3 RyR和IP3R的结构
1.4 昆虫RyR和IP3R
1.5 作用于昆虫RyR的新型杀虫剂
2 昆虫RNA干扰研究进展
2.1 RNAi的机制
2.2 昆虫dsRNA的导入方法和摄取机制
2.2.1 昆虫dsRNA的导入方法
2.2.2 昆虫dsRNA的摄取机制
2.3 影响昆虫RNAi效应的因素
2.4 RNAi技术在昆虫中的应用
2.4.1 基因功能研究
2.4.2 害虫控制研究
2.4.3 抗药性研究
3 本文研究目的和意义
第二章 赤拟谷盗两种细胞内钙离子通道基因的克隆与序列分析
1 材料与方法
1.1 供试虫源
1.2 主要试剂和仪器
1.2.1 主要试剂
1.2.2 主要仪器
1.3 试验方法
1.3.1 总RNA的提取及反转录
1.3.1.1 总RNA提取
1.3.1.2 cDNA模板的合成
1.3.2 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
1.3.3 感受态细胞制备
1.3.4 连接反应
1.3.5 连接产物的转化
1.3.6 α互补法进行重组质粒的筛选
1.3.7 PCR产物克隆
1.3.8 序列分析
2 结果与分析
2.1 赤拟谷盗鱼尼丁受体基因(TcRyR)全长cDNA序列克隆
2.2 赤拟谷盗1,4,5-三磷酸肌醇受体基因(TcIP3R)全长cDNA序列克隆
2.3 TcRyR和TcIP3R结构域预测
2.4 TcRyR C末端和N末端分析
2.5 TcRyR和TcIP3R基因组结构分析
2.6 选择性剪接外显子的确认
3 讨论
第三章 赤拟谷盗两种细胞内钙离子通道基因mRNA的表达分析
1 材料与方法
1.1 供试虫源
1.2 主要试剂和仪器
1.3 试验方法
1.3.1 RNA提取及反转录
1.3.1.1 总RNA提取
1.3.1.2 荧光定量PCR所用cDNA模板合成
1.4 荧光定量PCR
2 结果与分析
2.1 鱼尼丁受体基因在赤拟谷盗不同发育阶段的表达分析
2.2 1,4,5-三磷酸肌醇受体基因在赤拟谷盗不同发育阶段的表达分析
3 讨论
第四章 赤拟谷盗两种细胞内钙离子通道基因RNAi沉默研究
1 实验材料、仪器与试剂
1.1 试虫
1.2 实验仪器
1.3 实验药品与试剂
2 实验方法
2.1 双链RNA(dsRNA)合成
2.1.1 dsDNA合成
2.1.2 PCR产物回收
2.1.3 转录
2.1.4 纯化dsRNA
2.2 dsRNA注射
2.2.1 500×injection buffer的配置
2.2.2 dsRNA的注射
2.3 数据处理
3 结果与分析
3.1 RNA干扰效率分析
3.2 RNA干扰表型分析
4 讨论
参考文献
致谢
攻读硕士期间发表的学术论文目录
本文编号：3880785
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【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
第一章 文献综述
1 昆虫细胞内钙离子通道研究进展
1.1 细胞内钙离子通道
1.2 鱼尼丁受体和1,4,5-三磷酸肌醇受体
1.3 RyR和IP3R的结构
1.4 昆虫RyR和IP3R
1.5 作用于昆虫RyR的新型杀虫剂
2 昆虫RNA干扰研究进展
2.1 RNAi的机制
2.2 昆虫dsRNA的导入方法和摄取机制
2.2.1 昆虫dsRNA的导入方法
2.2.2 昆虫dsRNA的摄取机制
2.3 影响昆虫RNAi效应的因素
2.4 RNAi技术在昆虫中的应用
2.4.1 基因功能研究
2.4.2 害虫控制研究
2.4.3 抗药性研究
3 本文研究目的和意义
第二章 赤拟谷盗两种细胞内钙离子通道基因的克隆与序列分析
1 材料与方法
1.1 供试虫源
1.2 主要试剂和仪器
1.2.1 主要试剂
1.2.2 主要仪器
1.3 试验方法
1.3.1 总RNA的提取及反转录
1.3.1.1 总RNA提取
1.3.1.2 cDNA模板的合成
1.3.2 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
1.3.3 感受态细胞制备
1.3.4 连接反应
1.3.5 连接产物的转化
1.3.6 α互补法进行重组质粒的筛选
1.3.7 PCR产物克隆
1.3.8 序列分析
2 结果与分析
2.1 赤拟谷盗鱼尼丁受体基因(TcRyR)全长cDNA序列克隆
2.2 赤拟谷盗1,4,5-三磷酸肌醇受体基因(TcIP3R)全长cDNA序列克隆
2.3 TcRyR和TcIP3R结构域预测
2.4 TcRyR C末端和N末端分析
2.5 TcRyR和TcIP3R基因组结构分析
2.6 选择性剪接外显子的确认
3 讨论
第三章 赤拟谷盗两种细胞内钙离子通道基因mRNA的表达分析
1 材料与方法
1.1 供试虫源
1.2 主要试剂和仪器
1.3 试验方法
1.3.1 RNA提取及反转录
1.3.1.1 总RNA提取
1.3.1.2 荧光定量PCR所用cDNA模板合成
1.4 荧光定量PCR
2 结果与分析
2.1 鱼尼丁受体基因在赤拟谷盗不同发育阶段的表达分析
2.2 1,4,5-三磷酸肌醇受体基因在赤拟谷盗不同发育阶段的表达分析
3 讨论
第四章 赤拟谷盗两种细胞内钙离子通道基因RNAi沉默研究
1 实验材料、仪器与试剂
1.1 试虫
1.2 实验仪器
1.3 实验药品与试剂
2 实验方法
2.1 双链RNA(dsRNA)合成
2.1.1 dsDNA合成
2.1.2 PCR产物回收
2.1.3 转录
2.1.4 纯化dsRNA
2.2 dsRNA注射
2.2.1 500×injection buffer的配置
2.2.2 dsRNA的注射
2.3 数据处理
3 结果与分析
3.1 RNA干扰效率分析
3.2 RNA干扰表型分析
4 讨论
参考文献
致谢
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本文编号：3880785
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