水稻铜伴侣蛋白OsATX1在铜转运和分配中的功能研究

发布时间：2020-11-19 22:55

　　 铜(Cu)是生物体生长和发育所必需的微量元素,但过量的Cu也会对生物体造成毒害。控制作物中Cu离子的平衡,对提高作物产量和营养品质,以及人体健康都是十分重要的。铜伴侣蛋白ATX1(Antioxidant Protein1)是维持细胞内Cu离子平衡的一类重要蛋白。在本研究中,我们鉴定了一个水稻铜伴侣蛋白OsATX1,功能研究表明OsATX1影响了水稻中Cu离子的转运和分配。RT-qPCR结果表明,OsATX1受高浓度Cu和镉(Cd)的诱导表达,但不受高浓度铁(Fe)、锰(Mn)或锌(Zn)的影响。通过对携带OsATX1_(Pro):GUS/GFP(OsATX1启动子融合GUS(β-葡萄糖苷酸酶)和GFP(绿色荧光蛋白))的转基因水稻的分析,我们发现OsATX1主要在根部的外皮层和木质部细胞以及叶片维管组织中表达。水稻原生质体和烟草叶片表皮细胞的瞬时表达实验结果表明,OsATX1-GFP定位于细胞质,细胞核和细胞质膜,也可能依附于细胞内膜系统。OsATX1功能缺失会导致水稻根中Cu浓度增加,并降低了Cu由根向地上部的转移;超量表达OsATX1降低了根中的Cu浓度,但增加了植株地上部和木质部伤流液中Cu的积累,并促进了Cu由根向地上部的转移。在缺Cu条件下,OsATX1超量表达植株与野生型相比没有表现出明显的表型差异;但是超量表达OsATX1显著降低了水稻对高浓度Cu的耐受性。在生殖生长阶段,与野生型相比,OsATX1超量表达植株在新发育组织中的Cu浓度显著增加,包括穗,上部节点和节间,幼叶和叶鞘;而osatx1突变体植株在这些组织中的Cu浓度显著降低。另外,osatx1突变体植株在老叶中积累了较高的Cu浓度。OsATX1包含一个保守的MXCXXC铜离子结合结构域,能够与Cu~+离子结合,形成同源二聚体。酵母双杂交和双分子荧光互补(BiFC)实验结果表明,OsATX1能够与水稻重金属P_(1B)型ATP酶OsHMA4,OsHMA5,OsHMA6和OsHMA9互作。这些结果表明,OsATX1可能负责将Cu离子传递给水稻重金属P_(1B)型ATP酶进行Cu离子的转运和分配,从而维持水稻不同组织间的Cu离子平衡。超量表达OsATX1增加了地上部和木质部伤流液中的Cd积累,而osatx1突变体植株增加了根中的Cd浓度。在生殖生长阶段,超量表达OsATX1增加了地上部各个组织器官的Cd积累,表明OsATX1也可能参与水稻中Cd离子的转运。另外,在酵母(酿酒酵母)镉敏感突变体Δycf1中,异源表达OsATX1能够降低酵母细胞中Cu和Cd的浓度,从而提高了酵母对Cu和Cd的耐受性。综上所述,我们的研究结果表明,OsATX1促进了Cu由根向地上部的转运以及从老叶到新发育组织的再分配。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S511
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
    1.1 研究问题的由来
    1.2 铜元素的概述
    1.3 铜的生物学功能
    1.4 铜高积累植物的研究
    1.5 铜在植物体内的吸收和转运
        1.5.1 CTR/COPT转运蛋白
        1.5.2 P1B型 ATP酶/重金属ATP酶
        1.5.3 锌铁转运蛋白（Zinc/iron-regulated transporter protein,ZIP）
        1.5.4 类黄色条纹转运蛋白YSL（Yellow stripe-like protein）
        1.5.5 铜伴侣蛋白
        1.5.6 铜响应的microRNAs（Cu-microRNAs）
    1.6 植物对铜毒害的防御
        1.6.1 铜离子的螯合作用
        1.6.2 植物抗氧化系统
    1.7 镉元素概述
    1.8 镉在植物体内的吸收和转运
    1.9 本研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 基因编号和名称
    2.2 水稻材料
    2.3 菌株和载体
    2.4 遗传转化载体的构建与转化方法
        2.4.1 启动子融合载体的构建
        2.4.2 超量表达体的构建
        2.4.3 CRISPR载体的构建
        2.4.4 农杆菌介导的水稻遗传转化
    2.5 RNA表达分析和突变体基因型鉴定
    2.6 营养液培养
    2.7 金属元素含量分析
    2.8 木质部伤流液的提取
    2.9 GUS组织化学染色及琼脂切片
    2.10 水稻原生质体的瞬时表达
    2.11 烟草叶片的瞬时表达
    2.12 酵母双杂交实验
    2.13 酵母互补实验
        2.13.1 酵母互补测验
        2.13.2 酵母生长速率实验
        2.13.3 酵母细胞的元素含量分析
    2.14 蛋白质的原核表达及纯化
    2.15 铜离子结合实验
3 结果与分析
    3.1 OsATX1 基因的序列分析
        3.1.1 ATX蛋白的进化树分析
        3.1.2 ATX蛋白质结构域的分析
    3.2 OsATX1 组织表达模式分析
        3.2.1 OsATX1 的表达谱分析
        3.2.2 OsATX1 细胞水平的表达特点
    3.3 金属胁迫下OsATX1 基因的表达分析
    3.4 OsATX1 基因超量表达及突变体材料的获得与鉴定
    3.5 OsATX1 转基因植株的表型鉴定
    3.6 Fe,Mn,Zn和 Cu胁迫处理下OsATX1 转基因植株的表型分析
    3.7 OsATX1 亚细胞定位分析
    3.8 营养生长期OsATX1 转基因植株的Cu和 Cd梯度处理实验及元素含量分析
        3.8.1 OsATX1 影响了水稻中Cu由根向地上部的转运
        3.8.2 OsATX1 影响了水稻中Cd由根向地上部的转运
        3.8.3 超量表达OsATX1 增加了木质部伤流液中Cu和 Cd的积累
    3.9 抽穗期OsATX1 转基因植株不同器官组织中Cu和 Cd元素含量分析
        3.9.1 OsATX1 影响了水稻中Cu由老叶向新发育组织和穗中的转运
        3.9.2 超量表达OsATX1 增加了地上部不同组织中的Cd积累
    3.10 成熟期OsATX1 转基因植株糙米中元素含量分析
    3.11 OsATX1 能够结合Cu+离子
    3.12 OsATX1 与水稻P1B型重金属ATP酶 OsHMA4/5/6/9 的互作分析
        3.12.1 酵母中验证OsATX1与OsHMA4/5/6/9 互作
        3.12.2 BiFC验证OsATX1与OsHMA4/5/6/9 互作
    3.13 酵母中异源表达OsATX1 对酵母Cu和 Cd耐性的影响
        3.13.1 酵母中异源表达OsATX1 增加了酵母对Cu的耐性
        3.13.2 酵母中异源表达OsATX1 增加了酵母对Cd的耐性
4 讨论
    4.1 OsATX1 在水稻Cu转运和分配过程中的功能
        4.1.1 OsATX1 参与水稻中Cu从根向地上部的转运
        4.1.2 OsATX1 参与水稻地上部不同组织器官间的Cu分配过程
        4.1.3 超量表达OsATX1 降低了水稻对高铜胁迫的耐受性
    4.2 OsATX1 可能通过与OsHMA4/5/6/9 互作影响水稻Cu离子的转运和分配
    4.3 OsATX1 在水稻Cd转运和分配过程中的作用
    4.4 展望
参考文献
附录
    附录 Ⅰ 引物列表
    附录 Ⅱ 部分实验的详细操作步骤
    附录 Ⅲ 作者简介
致谢

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 李芳林;张凝宇;李辉;李倩兰;王金林;;氯化镉对人肾小管上皮细胞形态及生存率的影响[J];广西医学;2015年03期

2 吴茂江,涂长信;铜与人体健康[J];微量元素与健康研究;2005年05期

本文编号：2890554