烟草蛋白激酶NtGCN2抗体制备及其互作蛋白的初步筛选
发布时间：2022-12-07 19:59
在逆境胁迫环境下,生物会通过调节自身的蛋白合成来适应胁迫环境。其中,在胁迫和氮/氨基酸信号之间起到重要连接作用的一个蛋白激酶叫作GCN2（General Control Non-derepressible 2）,其主要作用是通过磷酸化真核起始翻译因子eIF2α（αsubunit of eukaryotic translation initiation factor 2）来调节蛋白的合成,从而对各种胁迫做出应答。目前,关于GCN2的研究在动物和微生物细胞中已经取得了较大的进展,而在植物中的研究相对较少,并且主要集中在拟南芥中。本研究根据烟草NtGCN2（GenBank登录号:KJ706220）的全长序列克隆出其功能域（Protein Kinases catalytic domain,PKc）序列,构建了原核表达载体pET15b-PKc,采用大肠杆菌表达菌BL21–CodonPlus-（DE3）-RIPL进行蛋白表达,采用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱、阴离子交换柱Hitrp Q和分子筛对获得的重组蛋白进行纯化,获得了纯化蛋白。采用该蛋白制备了相应的多克隆抗体,并检...
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
1 文献综述
1.1 GCN2 参与途径
1.1.1 GCN2 介导的e IF2 蛋白质翻译调控
1.1.2 GCN2 介导的GCN4 蛋白的翻译调控
1.1.3 GCN2 介导的ATF4 蛋白的翻译调控
1.2 GCN2 的结构
1.3 GNC2 的功能
1.4 GCN2 的研究现状
1.4.1 GCN2 对胁迫的响应
1.4.2 GCN2 的激活
2 引言
2.1 研究目的与意义
2.2 研究内容
3 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 实验仪器与设备
3.1.2 试剂
3.1.3 植物材料
3.1.4 常用试剂配置
3.1.5 常用培养基配置
3.2 实验方法
3.2.1 原核表达载体的构建
3.2.1.1 PCR反应体系
3.2.1.2 PCR产物的纯化
3.2.1.3 重组质粒的构建
3.2.1.4 菌落PCR验证
3.2.1.5 质粒的提取
3.2.1.6 重组质粒的酶切鉴定
3.2.1.7 DNA测序
3.2.2 IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)诱导的重组蛋白的原核表达
3.2.3 重组蛋白的提取
3.2.4 目的蛋白的纯化
3.2.4.1 Ni~(2+)-NTA琼脂糖柱纯化蛋白
3.2.4.2 阴离子交换柱Hitrap Q纯化蛋白
3.2.4.3 分子筛纯化蛋白
3.2.5 SDS-PAGE电泳
3.2.6 Western-blotting检测
3.2.7 GCN2 功能域(PKc)抗体制备
3.2.8 抗体的效价检测
3.2.9 免疫共沉淀(Co-IP)初步筛选烟草中与GCN2 存在相互作用的蛋白
3.2.9.1 烟草蛋白的提取
3.2.9.2 Co-IP实验方法
4 结果与分析
4.1 原核表达载体pET15b-PKc的构建
4.1.1 NtGCN2 功能域(PKc)基因的克隆
4.1.2 菌落PCR的验证
4.1.3 质粒验证
4.2 GCN2 功能域(PKc)的原核表达及Western blot鉴定
4.2.1 GCN2 功能域(PKc)的原核表达及条件优化
4.2.2 重组蛋白的Western-bloting鉴定
4.3 重组蛋白pET15b-PKc的纯化
4.3.1 Ni~(2+)-NTA琼脂糖柱初步纯化目的蛋白
4.3.2 阴离子交换柱Hitrap Q纯化目的蛋白
4.3.3 分子筛纯化目的蛋白
4.4 多克隆抗体的制备、纯化和效价检测
4.4.1 GCN2 全长蛋白多克隆抗体的制备与效价检测
4.4.2 GCN2 功能域(PKc)蛋白多克隆抗体的制备与效价检测
4.4.3 GCN2 功能域(PKc)多克隆抗体的鉴定与纯化
4.4.4 采用制备的PKc抗体检测转基因烟草GCN2 的表达
4.5 NtGCN2 互作蛋白的初步筛选
5 结论与讨论
5.1 讨论
5.2 结论
5.3 研究的创新点
参考文献
英文摘要
【参考文献】：
期刊论文
[1]烟草NtGCN2的克隆与表达分析[J]. 张康旭,刘国顺,李雯雯,王叶青,杨永霞,贾宏昉,张洪映,崔红,张松涛. 植物生理学报. 2014(09)
[2]改善稀有密码子和氨基酸残基限制提高重组人ADAM15去整合素结构域蛋白表达水平[J]. 吴静,雷楗勇,张莲芬,花慧,金坚. 微生物学报. 2008(08)
[3]重组人血管内皮抑制素（rh-Endostatin）大肠杆菌表达体系发酵条件的优化[J]. 常国栋,李壮林,秦加阳,马翠卿,罗永章,许平. 生物工程学报. 2005(04)
本文编号：3712744
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
1 文献综述
1.1 GCN2 参与途径
1.1.1 GCN2 介导的e IF2 蛋白质翻译调控
1.1.2 GCN2 介导的GCN4 蛋白的翻译调控
1.1.3 GCN2 介导的ATF4 蛋白的翻译调控
1.2 GCN2 的结构
1.3 GNC2 的功能
1.4 GCN2 的研究现状
1.4.1 GCN2 对胁迫的响应
1.4.2 GCN2 的激活
2 引言
2.1 研究目的与意义
2.2 研究内容
3 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 实验仪器与设备
3.1.2 试剂
3.1.3 植物材料
3.1.4 常用试剂配置
3.1.5 常用培养基配置
3.2 实验方法
3.2.1 原核表达载体的构建
3.2.1.1 PCR反应体系
3.2.1.2 PCR产物的纯化
3.2.1.3 重组质粒的构建
3.2.1.4 菌落PCR验证
3.2.1.5 质粒的提取
3.2.1.6 重组质粒的酶切鉴定
3.2.1.7 DNA测序
3.2.2 IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)诱导的重组蛋白的原核表达
3.2.3 重组蛋白的提取
3.2.4 目的蛋白的纯化
3.2.4.1 Ni~(2+)-NTA琼脂糖柱纯化蛋白
3.2.4.2 阴离子交换柱Hitrap Q纯化蛋白
3.2.4.3 分子筛纯化蛋白
3.2.5 SDS-PAGE电泳
3.2.6 Western-blotting检测
3.2.7 GCN2 功能域(PKc)抗体制备
3.2.8 抗体的效价检测
3.2.9 免疫共沉淀(Co-IP)初步筛选烟草中与GCN2 存在相互作用的蛋白
3.2.9.1 烟草蛋白的提取
3.2.9.2 Co-IP实验方法
4 结果与分析
4.1 原核表达载体pET15b-PKc的构建
4.1.1 NtGCN2 功能域(PKc)基因的克隆
4.1.2 菌落PCR的验证
4.1.3 质粒验证
4.2 GCN2 功能域(PKc)的原核表达及Western blot鉴定
4.2.1 GCN2 功能域(PKc)的原核表达及条件优化
4.2.2 重组蛋白的Western-bloting鉴定
4.3 重组蛋白pET15b-PKc的纯化
4.3.1 Ni~(2+)-NTA琼脂糖柱初步纯化目的蛋白
4.3.2 阴离子交换柱Hitrap Q纯化目的蛋白
4.3.3 分子筛纯化目的蛋白
4.4 多克隆抗体的制备、纯化和效价检测
4.4.1 GCN2 全长蛋白多克隆抗体的制备与效价检测
4.4.2 GCN2 功能域(PKc)蛋白多克隆抗体的制备与效价检测
4.4.3 GCN2 功能域(PKc)多克隆抗体的鉴定与纯化
4.4.4 采用制备的PKc抗体检测转基因烟草GCN2 的表达
4.5 NtGCN2 互作蛋白的初步筛选
5 结论与讨论
5.1 讨论
5.2 结论
5.3 研究的创新点
参考文献
英文摘要
【参考文献】：
期刊论文
[1]烟草NtGCN2的克隆与表达分析[J]. 张康旭,刘国顺,李雯雯,王叶青,杨永霞,贾宏昉,张洪映,崔红,张松涛. 植物生理学报. 2014(09)
[2]改善稀有密码子和氨基酸残基限制提高重组人ADAM15去整合素结构域蛋白表达水平[J]. 吴静,雷楗勇,张莲芬,花慧,金坚. 微生物学报. 2008(08)
[3]重组人血管内皮抑制素（rh-Endostatin）大肠杆菌表达体系发酵条件的优化[J]. 常国栋,李壮林,秦加阳,马翠卿,罗永章,许平. 生物工程学报. 2005(04)
本文编号：3712744
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