海南凡纳滨对虾机体内三种常见弧菌鉴定、分子血清型研究及其拮抗菌筛选

发布时间：2020-04-09 20:16

【摘要】：针对近年来海南养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)常暴发早期死亡综合症、白便综合症、发光病等重大流行性疾病,同时其机体内常携带大量弧菌的现象,本文选择海南临高新盈、海口荣山、万宁山根、东方四更和新龙、昌江昌化的重要代表性凡纳滨对虾养殖区的患病对虾,从48个病虾样品中共分离获得514株弧菌；采用3种弧菌的特异性PCR检测方法进行鉴定,结果表明,哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)91株,溶藻弧菌(V. alginolyticus)24株,副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)0株,其它弧菌399株；按照5%的比例随机抽取上述鉴定菌株开展16S rDNA序列分析和标准生理生化鉴定,结果与特异性PCR检测方法结果一致。因此,除了哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌外,海南地区养殖对虾机体内还存在多种其它弧菌。在良好水质环境中开展投喂和浸泡方式的回归感染试验结果表明,仅从东方分离的哈维氏弧菌PBVH3311具有明显的致病性,可产生与自然患病对虾相似的症状。因此,我们推测：海南地区的对虾弧菌病原绝大多数应该为严格依赖环境条件的条件致病性菌株,可通过改善养殖环境防止这些疾病的暴发。以肠杆菌基因间重复共有序列PCR (ERIC-PCR)技术对上述哈维氏弧菌和溶藻弧菌开展了分子血清型研究,结果表明：(1)对哈维氏弧菌而言,在45%的相似度时,91株哈维氏弧菌聚为1类群；在80%的相似度时,这些菌株分为14个类群(分子血清型),其中来自东方四更和新龙的发光病对虾机体内的36株哈维氏弧菌属同一个类群,而其他地区来源的菌株无明显的地域集中分布特征。(2)对溶藻弧菌而言,在45%的相似度时,24个菌株也完全聚为1类群；在80%的相似度时,这些溶藻弧菌分为15个类群,且无明显的地域集中特征。总之,除了从发光病对虾机体内分离的哈维氏弧菌外,从其它患病对虾机体内的分离的哈维氏弧菌和溶藻弧菌的遗传多样性都较高,未出现某一分子血清型集中分布的现象。因此,多种分子血清型哈维氏弧菌和溶藻弧菌存在于海南的患病养殖对虾机体内,这些菌株为潜在的细菌病原(原发或继发),所以,这两种细菌病的防治难度较大,对海南养殖凡纳滨对虾存在严重潜在威胁。采用琼脂扩散法及双层平板法,筛选PBVH3311的拮抗菌,结果表明WCPW15003、WCPW15004、HKPW15005这3株菌遗传稳定性高且均对PBVH3311有明显的拮抗效果,平均抑菌圈直径大小分别为16.93mm、23.54mm、 22.86mm。经16S rDNA序列分析和标准生理生化鉴定,这3株菌均被确定为杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)。毒力基因筛查结果表明,WCPW15003、WCPW15004、HKPW15005均无exoT、exoU、exoS、exoY、phzH、 phzM、phzⅠ、phzⅡ、apr、lasA、lasB、pilB等假交替单胞菌属的常见毒力基因；安全性养殖试验结果表明,当水体中拮抗菌菌液浓度为1.7×108 CFU/mL时,凡纳滨对虾[体重为(2.0±0.5)g/尾]仍未出现死亡及其他异常现象。同时,测定了这3株拮抗菌在不同温度(4℃、20℃、30℃、40℃)、盐度(0‰、25‰、50‰、75‰、100‰、125‰、150‰)、酸碱度(pH 3、5、7、9、11)的生长特性,结果表明,WCPW15003、WCPW15004、HKPW15005在温度为20℃-40℃、pH为5-9范围内生长较好,WCPW15003、WCPW15004在盐度为0-50%o、 HKPW15005在盐度为0-100‰范围内生长较好。进一步采用琼脂扩散法对3株拮抗菌的广谱抗菌性作了深入研究,结果表明,WCPW15003、WCPW15004、 HKPW15005对本文分离的91株哈维氏弧菌混合样品和24株溶藻弧菌的混合样品都有显著的拮抗效果,抑菌圈直径都大于5mm；对实验室保藏的10株其它哈维氏弧菌、2株溶藻弧菌和1株副溶血弧菌也有显著的拮抗效果,抑菌圈直径大于5mm。最后,以市售的高效拮抗菌产品为阳性对照,测定了这3株拮抗菌对凡纳滨对虾养殖水体中弧菌(终浓度2.1×107CFU/mL)的拮抗效果。结果表明,WCPW15003在96h时对弧菌的拮抗效果效果最为显著,5个不同浓度拮抗菌试验组(107 CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL)弧菌数量分别为4.6×106CFU/mL、1.08×107CFU/mL、1.05×107CFU/mL、1.5×107 CFU/mL、1.7×107CFU/mL,减少了78.1%、48.6%、50.0%、38.6%、19.0%；HKPW15005在96h时拮抗效果效果最为显著,各试验组(107CFU/mL、106 CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL)弧菌数量分别为4.9×105 CFU/mL、1.06×106 CFU/mL、4.9×106 CFU/mL、3.2×106 CFU/mL、4.8×106 CFU/mL,减少了97.7%、94.9%、76.7%、84.8%、77.1%; WCPW15004(终浓度103 CFU/mL)在120h时拮抗效果效果最为显著,弧菌数量为1.79×107CFU/mL,减少了14.8%。这3株拮抗菌为今后建立基于有益微生物制剂的海南凡纳滨对虾弧菌病的安全防控技术奠定了重要基础。
【图文】：

综合症,养殖场

（２０１４年７月）；海口荣山市某养殖场的患病对幰症状为吃料锐减，肠炎严重，逡逑生长缓慢，肠炎严重，体表有白斑，伴有白便，死亡率达到＾％１＾上（２0１４年８逡逑月）（图１）；万宁山根某养殖场的患病对奸症状为吃料锐减，空肠道，有伴白便，逡逑死亡率达到７０％Ｗ上（２０１４年８月）；昌江昌化某养殖场的患病对卧症状为卧体逡逑呈面条状软绵，肌肉白灼，巧萎缩，空肠道，有伴白便，，死亡率高达８５％Ｗ上（２０１４逡逑年１０月）。逡逑兴严：百碱苗．叩’．ｉｆｆｌ逡逑图１白便综合症患病对巧及白便逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｄｉｓｅａｓｅｄ邋ｓｈｒｉｍｐ邋ｗｉｔｈ邋ｗｈｉｔｅ邋ｆｅｃｅｓ邋ｓｙｎｄｒｏｍｅ逡逑３．１．邋２病原菌的分离逡逑在２０１３￣２０１５年间，从５个养殖区共采集４８份患病对卧样品。其中，４５份逡逑样品的肝族腺部位和１８份样品的肌肉部位均分离获得了大量弧菌，且同一幰体逡逑的肝族腺、肌肉部位分离的细菌在ＴＣＢＳ培养基上形成的菌落颜色与形态基本一逡逑致。其中，临高新盈养殖场病砰样品肝膀腺、肌肉部位的菌含量分别为（４．０邋＋逡逑０．８）邋ｘｉ0６ＣＦＵ／ｇ、（５．２＋１．２）邋ｘｌ0５ＣＦＵ／ｇ；东方四更和新龙四更和新龙养殖场病逡逑卧样品肝族腺部位的菌含量为（８．１±０．４）ｘｌ0５ＣＦＵ／ｇ，肌肉部位没有分离到弧菌；逡逑海日荣山养殖区的病邮样品巧族腺和肌肉部位均没分离到弧菌：万宁山根养殖场逡逑病虫下样品肝膜腺、肌肉部位的菌含量分别为（２．０６＋１．６）邋ｘｌ0６ＣＦＵ／ｇ、（８．３邋＋邋０．５）逡逑ｘｌＯNBＦＵ／ｇ；昌江昌化养殖场病邱样品肝膜腺部位菌含量为（４．１±２．３）ｘＩ0４ＣＦＵ／ｇ

逦海南大学硕壬学位论文逦逡逑肌肉部位没有分离到弧菌。ＴＣＢＳ培养基涂布后，３０邋‘Ｃ培养２０邋ｈ出现直径为１￣３逡逑ｍｍ、圆形光滑、粘稠的菌落，其中，多数为黄色菌落，少数为绿色菌落。从所逡逑有样本中，共分离得到５１４株弧菌。逡逑３．邋２病师体内菌种的鉴定逡逑３．邋２．邋１邋ＰＣＲ快速检测逡逑采用哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的特异性引物对分离的弧菌进行快逡逑速检测，结果表明，５】４株弧菌中哈维氏弧菌９１邋（表８）、溶藻弧菌２４株（表９）、逡逑副溶血弧茜０株。其中，哈维氏弧菌（３６３ｂｐ）分别为分离自临高新盈（ｎ＝９）的逡逑９个白便综合症样品、东方四更和新龙（ｎ＝４０）邋（３６株分离自发光病的９个样品）逡逑的１２个白便综合症和发光病的样品、万宁山根（ｎ＝３０）的９个白便综合症样品、逡逑昌江昌化（ｎ＝Ｉ２）的９个偷死病的样品（图２）。溶藻孤菌（２５３ｂｐ）分别为分离逡逑自东方四更和新龙（ｎ＝１０）的１２个白便综合症和发光病样品、万宁山根（ｎ＝５）逡逑的９个白便综合症样品、昌江昌化（ｎ＝９）的９个偷死病样品（图３）。逡逑
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S945.49

【参考文献】