拟穴青蟹咽侧体抑制素A型（AST-A）生殖调控作用研究

发布时间：2020-04-10 12:35

【摘要】：咽侧体抑制素(Allatostatin,AST)是一类存在于昆虫中能够抑制咽侧体合成保幼激素(Juvenile hormone,JH)的多效神经肽。根据其结构特点该神经肽家族分为三种类型,分别为:A-typeAST(AST-A)、B-typeAST(AST-B)、C-type AST(AST-C)。在昆虫中,AST家族神经肽有多种生物学功能,其中一个重要的功能是能够影响生殖过程。迄今,AST在甲壳动物中的研究尚少,尤其在生殖作用机制方面更是凤毛麟角。为了探究AST-A对甲壳动物生殖过程的影响,本研究采用qRT-PCR、RACE、原位杂交、体外培养、RNA干扰等技术,从拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)中获得SpAST-A 和其受体SpAST-AR 的cDNA 片段,运用实时定量PCR技术检测了SpAST-A基因在拟穴青蟹中的组织分布、在不同发育期脑神经节中和不同发育期卵巢中的表达谱,以及SpAST-AR在不同发育期卵巢中的表达差异;运用原位杂交技术,对SpAST-A和SpAST-AR在脑神经节和卵巢中进行定位;体外培养添加SpAST-A,运用实时定量PCR技术检测卵巢相关基因的表达谱;运用RNA干扰技术,体外干扰SpAST-AR基因后检测相关基因的表达谱。主要结果如下:1)SpAST-A的神经内分泌研究:克隆得到拟穴青蟹SpAST-A的基因片段676 bp,编码225个氨基酸。根据AST-A的保守结构,从编码得到的氨基酸序列可以找到10个SpAST-A小肽。实时定量PCR表明SpAST-A在检测的卵巢、脑神经节等6个组织中均有表达,在脑神经节中表达量最高。SpAST-A在不同发育阶段的脑神经节中的表达情况:在卵黄发生前期表达量最高,在卵黄发生早期的表达量最低,在卵黄发生后期的表达量相对较高。原位杂交结果显示,SpAST-A在脑神经节中定位在第10和第11细胞群。上述结果表明拟穴青蟹脑神经节是SpAST-A合成的重要场所。2)SpAST-A的生殖自分泌研究:克隆得到拟穴青蟹SpAST-AR的基因片段704 bp,编码234个氨基酸。氨基酸序列分析结果显示,具有5个跨膜结构,同源性分析表明该蛋白应该属于G蛋白偶联受体家族。SpAST-A和SpAST-AR在不同发育期卵巢中的表达趋势相似,在卵黄发生前期的表达量较高,在卵黄发生早期的表达量最低,卵黄发生后期表达量最高。原位杂交结果显示,SpAST-A和SpAST-AR都定位在卵母细胞中,由此可以推测SpAST-A对拟穴青蟹卵巢发育的调控作用可能属于自分泌方式。AST-A小肽体外添加实验结果表明,AST-A1-4和AST-A1-5两条小肽在低浓度(10-7M和10-9M)下对卵巢组织Cyclin B和VgR基因的表达都有抑制作用,并且10-9M浓度下的抑制作用最明显;AST-A1-4和AST-A1-5两条小肽都使SpAST-AR基因的相对表达量升高了。我们推测。SpAST-A小肽与受体结合后能够抑制卵巢发育和卵黄发生。利用RNAi技术体外干扰SpAST-AR基因后再添加SpAST-A小肽,结果显示SpAST-AR基因下调可以解除对CyclinB和VgR基因的抑制作用,该结果再次验证了SpAST-A对卵巢发育和卵黄发生可能存在抑制作用。综上所述,拟穴青蟹,SpAST-A可能以神经分泌和自分泌两种方式抑制卵巢发育,该结果可以为甲壳动物繁殖技术研发提供科学依据,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。
【图文】：

序列,脑神经节,青蟹,卵巢

图２－１拟穴青蟹总ＲＮＡ电泳图逡逑ＣＧ：脑神经节：Ｏｖ：卵巢；Ｍ：邋Ｍａｋｅｒ

青蟹,区域预测,信号肽,脑神经节

逑ＣＧ邋Ｏｖ邋Ｍ逡逑画逡逑图２－１拟穴青蟹总ＲＮＡ电泳图逡逑ＣＧ：脑神经节：Ｏｖ：卵巢；Ｍ：邋Ｍａｋｅｒ。逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｆｒｏｍ邋Ｓ．邋ｐａｒａｍａｍｏｓａｉｎ逡逑ＣＧ，邋ｃｅｒｅｂｒａｌ邋ｇａｎｇｌｉｏｎ；邋Ｏｖ，邋ｏｖａｒｙ；邋Ｍ，，邋ｍａｒｋｅｒ．逡逑２．３．２邋５＞ＡＳＴ－Ａ基因的鉴定逡逑Ａ．序列分析逡逑克隆得到６７６邋ｂｐ的片段，都处在ＯＲＦ中，编码了邋２２５个氨基酸，序列如逡逑图２－２。根据ＡＳＴ－Ａ的结构特点及酶切位点（ＫＲ或ＫＫ）邋［４］
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

【参考文献】