多组学研究大西洋鲑抵御杀鲑气单胞菌的分子机制

发布时间：2020-04-21 07:37

【摘要】：杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida,A.salmonicida),作为最主要的一种可以引起鱼体疖疮病的细菌,正影响着全世界范围内的鲑科鱼类的养殖,尤其是大西洋鲑(Salmo salar)的养殖。为了增加我们对这个病原菌的了解,同时从大西洋鲑体内筛选出可以用来抵抗该病菌侵袭的潜在生物指示因子,我们采用代谢组学、蛋白质组学、磷酸化蛋白质学和分子生物学的方法进行实验分析和筛选。由于该细菌主要发病的器官是鱼体的重要免疫器官-肾脏组织。因此,我们将肾脏作为本实验研究的主体。另外,我们从实验分析的组学数据中筛选出醛脱氢酶家族的7A1蛋白(ALDH7A1),并将其进行蛋白重组表达纯化。发现其在大西洋鲑感染杀鲑气单胞菌的早期,有着明显的抗杀鲑气单胞菌的能力并且可以显著降低鱼体的死亡率。所有得到的主要结果如下所示:1代谢组学对感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑的肾脏组织进行分析本部分实验中,我们首次通过~1H核磁共振(NMR)光谱分析法来分析感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑的肾脏组织中代谢物的变化情况。通过NOESYPR1D光谱、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析模型(OPLS-DA)两种多元化分析(刘鹏飞,2015),对7天和14天的高浓度感染实验组与对照组中的实验大西洋鲑的肾脏组织进行比较分析。本部分实验最主要的目的就是筛选出可以抵抗杀鲑气单胞菌感染鱼体的重要代谢物,同时进一步了解该病菌在大西洋鲑体内的致病机理。经分析,我们发现分布在TCA循环、糖酵解/糖异生、色氨酸代谢和尿素循环等四大代谢通路中的延胡索酸盐、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、天冬氨酸盐、胆碱、磷酸胆碱和甜菜碱等9种差异代谢物,可能是由于杀鲑气单胞菌的刺激和影响,而在鱼体内出现明显增高的表达趋势。2蛋白质组学对感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑的肾脏组织进行分析本部分实验通过高通量蛋白质组学(iTRAQ标记法),对在7天和14天两个高、低浓度不同的感染杀鲑气单胞菌的实验组中的大西洋鲑的肾脏组织进行分析和鉴定。我们通过LC/MS/MS质谱仪分析后共筛选出4009个总蛋白。随后,我们将140个差异极显著的蛋白(差异倍数≥1.5和P0.01)进行蛋白网络互作分析,共筛选出39个蛋白可以作为大西洋鲑抵抗杀鲑气单胞菌侵袭的潜在生物指示因子。然后,我们从中筛选了9个重要的差异蛋白进行实时定量PCR来检验这些基因的转录水平表达情况,发现与蛋白水平变化基本相同。本实验是第一次通过iTRAQ技术对感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑的肾脏组织进行分析鉴定,最终我们推测甘油醛-3-磷酸脱氢酶、醛脱氢酶家族7A1、醛脱氢酶家族9A1、L-乳氨酸脱氢酶B链、羟烷基-辅酶A脱氢酶、β-血红蛋白亚基、α-4-血红蛋白亚基、T-复合蛋白1-eta亚基、磷酸丙糖异构酶-A和补体因子B等10个蛋白可作为潜在的生物指示因子进行深入研究。3 ALDH7A1蛋白可以保护大西洋鲑抵抗杀鲑气单胞菌醛脱氢酶家族(ALDHs)是一个具有解毒功能的超级蛋白家族,同时该家族蛋白在维持上皮细胞内稳态,并保护细胞免受醛类毒素的影响和抗药性上有着重要的作用。然而,对于这些解毒蛋白如何行使功能,我们至今还无从得知。在本部分的研究中,我们表达并纯化了ALDH7A1蛋白来研究其在感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑时的作用。我们首先通过SDS-PAGE和western blot的方法来验证重组表达的ALDH7A1(rALDH7A1)蛋白。该蛋白分子量大概为58.9 kDa,等电点为7.09,且该重组蛋白并无信号肽分子,而氨基酸序列中只有一个低复杂区域(~14141 yvegvgevqeyvdv ~(153))。另外,ELISA的结果表明,rALDH7A1可以与杀鲑气单胞菌结合。且ALDH7A1的基因在鱼的肾脏、肝脏、肠、和血液中表达最高(依次降低),而在鳃和脾中表达最低。随后再通过实时荧光定量PCR检验大西洋鲑的肾脏组织后,我们发现注射rALDH7A1蛋白的感染杀鲑气单胞菌的实验组中,在感染早期,杀鲑气单胞菌的拷贝数明显低于同浓度的感染实验组。与此同时,我们测定了在肾脏和脾脏组织中,NF-kB、P-38 MAPK、caspase-3和TNF-α等4个基因的表达情况。结果表明,主要在72 h的rALDH7A1+高/低浓度感染组的肾脏和肝脏中,这4个基因受到rALDH7A1蛋白的作用表达量明显高于其他实验组,而在脾脏组织中则是在12 h时,在rALDH7A1+高/低浓度感染组中出现与72 h相同的变化趋势。再通过体内中和实验,我们发现rALDH7A1+高/低浓度感染组中的鱼与BSA和PBS对照组相比,鱼的死亡率会降低并出现明显延后致死的情况。4磷酸化蛋白质组学对感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑的肾脏组织进行分析本部分实验通过磷酸化蛋白质组对感染细菌时显著差异表达的蛋白的磷酸化位点进行分析。这是首次对感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑进行磷酸化位点的鉴定。经分析,共有3112个蛋白含5635个磷酸化位点被鉴定到,并以1.5倍差异倍数为基础,共鉴定到1502个上调蛋白和77个下调蛋白。再结合之前得到的蛋白质组学的数据以及基序(motif)分析,我们推测5个在免疫过程和细胞通路中调控细胞凋亡和细胞骨架的激酶(VRK3,GAK,HCK,PKCδ和RSK6)可以作为研究大西洋鲑抵抗杀鲑气单胞菌侵袭的潜在生物因子。另外,通过蛋白网络互作图分析,我们发现fga在整个蛋白网络的最中心部位,同样可能在感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑体内起着重要的调控作用。
【图文】：

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图 1.1 感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑的症状。Fig. 1.1 Symptom in Atlantic salmon infected by A. salmonicida.1.2. 杀鲑气单胞菌在大西洋鲑中的研究进展1.2.1. 杀鲑气单胞菌致病机制研究之前有研究表明，III 型分泌系统（TTSS）是引起杀鲑气单胞菌在大西洋鲑中致病性毒力因子（Burr et al.，2002；Dacanay et al.，2003；Dacanay et al.，2006；Vipond et al.，，1998）。TTSS 主要是通过产生一种效应因子，将细菌从细胞质中直接导入到宿主细胞的胞液中（He et al.，2004）。随后，当携带 TTSS 细菌与宿主中的巨噬细胞相结合后，该效应因子可以抑制巨噬细胞细胞信号通路，从而

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多组学研究大西洋鲑抵御杀鲑气单胞菌的分子机制(4) 通过磷酸化蛋白质组学，对高浓度（107CFU/mL）感染杀鲑气单胞菌 7 天时的大西洋鲑的感染组和对照组的肾脏组织进行比较，筛选出感染组中重要的磷酸化差异蛋白质和磷酸化位点。本文的技术路线如图 1.2 所示。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S941.42

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