尼罗罗非鱼IgM、IgT重链基因的克隆及表达

发布时间：2020-04-22 14:06

【摘要】：尼罗罗非鱼(Niletilapia，Oreochroms Niloticus)由于具有生长速度快、肉质鲜美、繁殖能力强等特点,近几十年来,其生产得到了迅速发展,但随着高密度化的养殖,鱼类不断受到多种微生物的入侵,造成鱼群的大量死亡,与之相比鱼类病害的防治几乎停留在化学治疗时期。目前很多研究证实:鱼类是有颌类脊椎动物中最早具有比较完整免疫系统的种群,其中免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是鱼类体液免疫应答的主要效应分子,因此对鱼类Ig研究不仅能为鱼类免疫学、遗传学的研究和认识脊椎动物免疫系统的进化规律提供一定的理论基础,同时也能为鱼类病害的免疫防治提供理论依据。本文经过分析尼罗罗非鱼性腺转录组数据及利用RACE技术得到了尼罗罗非鱼sIgM、mlgT重链cDNA全长。其中sIgMcDNA全长为1919bp，，5'非编码区包含233bp,3'非编码区有140bp,包含加尾信号(AATAAA)和poly(A),开放阅读框则包含1545 bp,编码514个氨基酸,分为5个功能区,1个可变区和4个恒定区。多序列比对发现V区由2个骨架区FR3、FR4和2个互补决定区CDR2、CDR3组成。FR3中存在重链可变区Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ家族保守区域YYCAR，FR4中存在V家族的保守区域FDYWGKGT-VTV-S,4个恒定区存在保守的半胱氨酸、色氨酸位点,CH3中还存在功能不明确Phe/Tyr-X-Cys-X-Val-X-His和C1q结合的His-X-Asp-X-X-X-Pro 保守区域。而mIgTcDNA全长为 1759bp，5'非编码区包含29bp，3'非编码区有209bp,包含加尾信号(AATAAA)和poly(A),开放阅读框包含1521bp,编码506个氨基酸,分为4个功能区:1个可变区和3个恒定区。可变区由1个前导链、4个骨架区(FR1、FR2、FR3、FR4)和 3 个高变区(CDR1、CDR2、CDR3)组成。而3个恒定区分别为τ1、和τ4,缺少τ3恒定区,且τ1的基因座与IgM中μ1的基因座一致，τ2和τ4位于μ1基因座的上游。此外跨膜区存在疏水性、亲水性氨基酸组成的CART(conserved antigen receptor transmembrane)。在进化树分析中IgT与红鳍东方渶(Takifugu rubripes)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)和鳜(Siniperca chuatsi)IgT/Z聚为一枝,而IgM与南极鱼(Chaenocephalus aceratus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)和鳜IgM聚为一枝。不同发育时期RT-PCR检测结果显示:IgM在受精初期的表达量较低,基本检测不到表达,在受精后25 d整鱼中检测到明显表达,而IgT在受精后8 d鱼中就能检测到表达,且IgM、IgT的表达量随鱼的发育呈上升趋势。各组织RT-PCR结果表明,IgM主要在4月龄、6月龄鱼的头肾、肠及脾脏中表达,其次在脑、肾、皮肤、卵巢、精巢及鳃中表达,而IgT主要在4月龄、6月龄鱼的头肾、脾脏中表达。嗜水气单孢菌刺激尼罗罗非鱼后,不同组织的qPCR检测结果表明:IgT在肠、脾脏、鳃、肾、头肾中的表达分别在刺激后2d、1d、Id、2d、Id显著性增强,在皮肤中的表达没有明显增强;而IgM则在刺激后7 d、7 d、7 d、12 h的皮肤、鳃、肾、头肾中的表达显著性增强,肠中的表达量基本一直处于对照水平。通过原核表达载体PSUMO、PET-28a,分别构建了 PSUMO-IgMCH2-4、PET-28a-IgT CH2-3、PSUMO-IgT CH3 重组质粒,利用 IPTG 在大肠杆菌 BL21 分别诱导出以包涵体形式大量表达的目的蛋白。以纯化后的IgM CH2-4、PET-28a-IgT CH2-3蛋白为抗原,免疫6-8周龄Balb/c雌性小鼠制备抗体。ELISA测定抗血清效价分别为1:20000、1:40000。间接ELISA检测重组蛋白IgM抗体识别表位结果显示:该抗体只能与尿素处理的尼罗罗非鱼全血清发生反应;Westem blotting结果表明:抗血清不仅能识别重组蛋白IgM,而且能与尼罗罗非鱼全血清中分子量为76.6kDa的蛋白发生特异性反应。此外还用细胞融合技术制备了抗IgT的单克隆抗体,最终筛选到一株能稳定分泌抗IgT CH3抗体的杂交瘤细胞株G9-B5。本研究制备的抗体为进一步了解尼罗罗非鱼B细胞类型、特性及功能奠定了基础。
【图文】：

分布图,尼罗罗非鱼,组织表达,分布图

４．４实验结果逡逑４．４．１尼罗罗非鱼ＩｇＭ、ＩｇＴ邋ＲＴ－ＰＣＲ结果逡逑不同发育时期ＲＴ－ＰＣＲ检测结果显示（图４．１ａ）邋：邋ＩｇＭ在受精初期的表达量比逡逑较低，基本检测不到表达，在受精后２５邋ｄ整鱼中明显检测到表达，而ＩｇＴ在受精逡逑２７逡逑

重组蛋白,尼罗罗非鱼

５．４．１尼罗罗非鱼ＩｇＭ邋ＣＨ２－４重组蛋白的诱导及纯化逡逑尼罗罗非鱼ＰＳＵＭＯ－ＩｇＭ邋ＣＨ２－４重组菌体总蛋白经１２邋％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，结果逡逑如图５．１所示。结果表明：在ＩＰＴＧ诱导下，大肠杆菌菌体总蛋白中出现一条目的逡逑ｋＤ逦Ｍ邋１逦２逦３逦４逦５逦６逡逑１１６邋一逡逑６６．２逦—逡逑４５．０逦一~k＿逡逑３５．０逦—＾逦：逡逑２５．０逦—邋＝逡逑１８．４逦．一运逦？逦—逡逑１４邋４逡逑图５．］邋ＩｇＭ重组蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图逡逑Ｆｉｇ．５．１邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ＩｇＭ逡逑Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；邋１．未诱导菌体总蛋白；２．诱导菌体总蛋白；３、４．诱导后破菌上清、沉淀；５．纯化重组蛋白；６．ＵＬＰ１逡逑Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ；邋１．ｔｏｔａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｆｒｏｍ邋ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ邋ＰＳＵＭＯ－ＩｇＭ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ＢＬ２１；邋２．ｔｏｔａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｆｒｏｍ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＰＳＵＭＯ－ＩｇＭ逡逑ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ＢＬ２１；邋３＆４．ｓｕｐｅｍａｔｅ邋ａｎｄ邋ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｆｒｏｍ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＰＳＵＭＯ－ＩｇＭ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ＢＬ２１；邋５．ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ逡逑ｐｒｏｔｅｉｎ；邋６．ＵＬＰ１逡逑条带，且该条带的分子量与理论估计的相对分子量大小５０．０邋ｋＤａ相符；而未诱导的逡逑菌体总蛋白无明显的重组目的蛋白表达。未诱导组与诱导组比较
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4

【参考文献】