SP600125诱导鱼类细胞多倍化的分子机制研究

发布时间：2020-04-24 10:00

【摘要】：前期研究发现化学小分子SP600125能够诱导鱼类细胞发生多倍化并成功获得稳定的同源四倍体鲫鱼细胞系。为进一步了解SP600125诱导鱼类细胞多倍化的分子机制,本研究通过RNA-seq方法获取SP600125处理组和对照组细胞的差异基因表达谱,利用GO和KEGG通路富集分析全面挖掘SP600125诱导细胞多倍化和细胞稳态维持相关的信号调控网络和关键功能基因,旨在揭示SP600125诱导鱼类细胞多倍化的作用机制,以期为SP600125在鱼类发育生物学的研究以及多倍体培育中的应用提供理论依据和技术参考。具体结果如下:1.高通量测序分析SP600125处理细胞全转录组水平的变化采用高通量测序技术,对体外培养的二倍体鲫尾鳍细胞和SP600125处理组细胞进行了转录组测序和比较分析。获得96,997个unigenes并对unigenes进行了GO功能注释和KEGG通路富集分析。比较SP600125处理组与对照组共获得差异表达基因4516个,其中显著上调有2670个,显著下调有1846个。差异基因主要与细胞代谢、应激反应、发育过程以及细胞周期调控相关。结果显示SP600125诱导引起一批细胞增殖调控相关功能基因尤其以细胞周期检测点相关基因表达水平的改变最为突出,表明SP600125对细胞周期检验点的多重调控与其实现鱼类细胞多倍化的诱导密切相关。2.p53信号通路对SP600125诱导细胞多倍化的调控作用基于转录组学分析的结果,进一步鉴定了与细胞周期检测点密切相关的p53信号通路在SP600125诱导细胞多倍化中的作用。根据已建立的SP600125诱导多倍化的间隔循环策略,利用qRT-PCR和Western blot技术检测SP600125处理对p53信号通路相关基因的mRNA和蛋白水平的影响,结果表明SP600125诱导引起p53、Mdm2、p21和Gadd45ɑ等细胞周期调控相关功能基因的mRNA表达水平产生显著上调,这与转录组分析的结果具有一致性;Western blot结果亦表明SP600125处理48h后细胞中的p53、MDM2和p21的蛋白表达明显上调。为进一步验证p53通路在SP600125诱导细胞多倍体中的作用,以p53抑制剂PFT-ɑ孵育细胞,结果显示PFT-ɑ处理可以在一定程度上降低SP600125对细胞周期G_2/M期的阻滞和减少多倍体细胞的产生。以上结果表明p53通路通过调控细胞周期发生G_2/M期阻滞参与SP600125诱导鱼类细胞多倍化的产生。3.纺锤体检测点(SAC)基因对SP600125诱导细胞多倍化的影响细胞学观察显示经SP600125处理导致细胞停滞于有丝分裂期。转录组学分析和qRT-PCR验证结果均表明SP600125导致细胞CyclinBl/3、Cdc2、Securin以及负责与动点粘附和对染色体分离监控的纺锤体检验点(SAC)相关基因Bub1、Mad2和Cdc20的mRNA水平呈下调性变化。Western blot结果进一步证实SP600125诱导引起细胞中的BUB1、MAD2和CDC20蛋白的表达水平下降。利用腺病毒成功构建了纺锤体检验点(SAC)核心蛋白MAD2的过表达重组载体(pAd-mCMV-MAD2-3-Flag-GFP-pA)。结合qRT-PCR、Western blot技术以及流式细胞仪分析,进一步鉴定了过表达MAD2对SP600125诱导细胞多倍化的影响。结果证实过表达MAD2能明显减弱SP600125间隔循环处理所引起细胞多倍体的发生。以上结果表明经SP600125诱导引起CyclinBl-Cdc2复合物和纺锤体检验点(SAC)活力下降导致有丝分裂滑移和核内有丝分裂共同产生细胞多倍化。4.急性免疫应激参与SP600125胁迫下的细胞内稳态维持调节基于转录组测序分析,二倍体鲫尾鳍细胞经SP600125处理后能够引起大量免疫炎症相关基因表达水平发生显著的改变,其中涉及到参与先天防御、炎症途径和细胞粘附分子相关途径包括促炎细胞因子(如IL-1β、TNF-ɑ和IL-6R)、转录因子信号转导分子(如Stat-1/3和IκB)、细胞粘附分子(如Vcam-1)和整合素(ɑ2β1和ɑMβ2)等。同时SP600125处理导致线粒体不仅在形态和数量发生明显改变而且在Glut1和主要糖酵解酶基因(如Hk1、Pfbfk、Pgam、Eno和Ldh)的mRNA水平显著降低以及线粒体电子传递链基因(如NADH脱氢酶的Nd1、Nd2和Nd5复合体I亚基基因、Adh、Ndufs8、Ndufa4、Uqcr和Sdhd等)的mRNA水平也显著下调。相关研究结果揭示了在SP600125的胁迫下细胞通过应激免疫响应和降低氧化磷酸化水平等措施参与细胞内稳态的维持。结论:(1)转录组学分析表明SP600125对细胞周期检验点的多重调控与其实现鱼类细胞多倍化的诱导密切相关。(2)SP600125诱导增强了p53信号通路的G_2/M期阻滞并导致纺锤体检验点(SAC)信号削弱引发的有丝分裂滑移和核内有丝分裂从而实现鱼类细胞多倍化。(3)在SP600125胁迫下细胞通过应激免疫响应和降低氧化磷酸化水平等措施参与细胞内稳态的维持。研究结果为SP600125在鱼类发育生物学研究和生产实践中的应用奠定了理论基础。
【图文】：

多倍体,真核生物

图 1-1 真核生物中存在的多倍体[9]植物(绿色)、动物(蓝色)和真菌(黄色)多倍体的演化过程。红点表示支持的全基因组复制事件；黄点表示推测的整个基因组复制事件。Figure 1-1 Polyploidy in eukaryotes. polyploidyzation events occurred in the evolution of plants(green)animals(blue)and fungi(yellow). Well-supported whole genome duplication events areindicated by a red dot. Yellow dots indicate speculated whole genome duplication events.在正常生理发育过程中，多倍体细胞的产生与其发育和终端分化、物质储存和吸收、机体稳态维持且具有较强的可塑性，此外在代谢压力以及抵御不良环境等细胞应激(如在衰老、高血压和伤口愈合)条件下而产生多倍体细胞来增强新陈代谢以其来更好地适应各种应激[20-22]。在肝脏中多倍体细胞存在的比例与年龄的增长、氧化应激、端粒缩短及肝脏切除术后的肝细胞再生有关[23-24]。普遍认为个体中这些多倍体细胞的出现可以保护细胞基因组不被损毁，同时也是抵抗各种损伤、毒性物质的选择性结果[25]。

胞质分裂,有丝分裂,检查点,细胞周期

SP600125 诱导鱼类细胞多倍化的分子机制研究1.2 多倍体细胞形成的机制细胞对 DNA 损伤的应激响应主要是通过细胞周期检查点(cell cyclecheckpoint)来激活细胞的信号转导途径并将细胞周期阻滞在其中的某个时期，，给细胞留出足够的时间进行 DNA 修复损伤直到修复完成时，才会进入下一个时期来避免将受损的基因复制遗传给下一代，这样有利于维持基因组的稳定性和细胞的存活[26]。根据在细胞周期中的时间顺序将细胞周期检查点主要分为 G1/S 检查点、G2/M 检查点、中后期检查点(纺锤体组装检查点)，它们分别负责查看有无DNA 损伤，DNA 复制错误和染色体是否正确分配，在如此这样的一套精细的调控机制下来确保细胞周期各时相有序的进行[26](图 1-2)。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

【参考文献】