克氏原鳌虾产ESBLs大肠杆菌耐药性研究

发布时间：2020-05-08 11:07

【摘要】：近些年,伴随着抗生素的大量生产和使用,细菌耐药性已经成为全球性的公共卫生问题。现已发现在多种环境介质如土壤、水体、水生生物中存在耐药细菌。克氏原鳌虾生活在淡水水体如湖泊、河流等环境内,这些环境中细菌种类丰富,细菌的耐药基因呈多样性,不同种属的细菌之间可以通过质粒、转座子等移动原件进行耐药基因交换,并将耐药基因扩散、传播给其他物种。现阶段,我国对水产细菌耐药性研究及监测远没有对人和畜禽细菌耐药性研究的深入和系统。为研究我国克氏原鳌虾源产ESBLs大肠杆菌的耐药水平,获得耐药本底数据,阐明耐药基因扩散和水平传播机制,本研究采集来自山东、湖北、浙江、江苏、辽宁五省共198份克氏原鳌虾活体样品,通过头孢噻肟抗性(8μg/m L)选择性培养基培养、PCR方法和BD PhoenixTM-100 system全自动微生物鉴定/药敏系统分离、鉴定产ESBLs大肠杆菌;然后通过全自动微生物鉴定/药敏系统、双纸片协同作用对其药物敏感性进行检测;根据药物敏感性检测结果,使用多重PCR等方法筛选β-内酰胺酶耐药基因、质粒介导喹诺酮耐药基因(PMQR)和16s r RNA甲基化转移酶等耐药基因;通过接合转移实验来确定耐药基因扩散、传播水平及机制。结果显示:从来自山东、湖北、浙江、江苏、辽宁五个省份共计198份克氏原鳌虾活体样品中分离鉴定出107株产ESBLs大肠杆菌,ESBLs阳性分离率为54.0%;所有样品分离株对青霉素类、一代头孢菌素和部分三代头孢菌素均耐药;对四环素类、喹诺酮类、氯霉素类和磺胺类药物耐药率均在60%以上(65株);对氨基糖苷类药物耐药率较低;多重耐药菌株(R≥3类药物)占比例为86.7%(96/107),且以5类(30%,31/107)和6类(28%,30/107)耐药为主。对107株虾源产ESBLs大肠杆菌样品进行耐药基因鉴定,结果表明它们均携带bla CTX-M基因,其中以bla CTX-M-1群基因(74%,78/107)最普遍,其次是bla CTX-M-9群基因(20%,21/107)、bla CTX-M-2群基因(7.48%,8/107),只有一株分离菌株同时携带bla CTX-M-1群基因和bla CTX-M-9群基因;而bla Amp C类基因阳性菌株共9株(8.4%),其中以bla CMY-2亚型为优势型(87.5%,7/8),其次为bla CMY-42型,这是首次在我国动物源食品ESBLs大肠杆菌中检测到bla CMY-42型基因,另外一株为bla DHA-1阳性(0.9%),其他基因如bla MOX、bla ACC、bla EBC、bla FOX和bla SHV均未检出。此外,在样品分离株中检测到54株携带bla TEM基因(50.5%),且均为非ESBLs型的bla TEM-1亚型。总体来说,五省均保持一致性,以bla CTX-M-1群基因为主。在检测107株产ESBLs样品大肠杆菌携带可移动、非β-内酰胺类耐药基因时发现,携带qnr S基因的菌株有38株,检出率为35.5%(38/107),以qnr S1型和qnr S2型为主,其次是携带oqx A基因(33.6%,36/107),携带oqx B基因(32.7%,35/107)和携带aac(6’)-Ⅰb-cr基因(18.7%,20/107),qep A基因的阳性检出率仅为1.87%(2/107);在PMQR组合中,oqx A+oqx B基因组合最常见(31.8%,34/107),同时携带2种以上喹诺酮基因的菌株有37株,是主要的耐喹诺酮类药物的机制。对16s r RNA甲基化转移酶基因进行检测后,发现部分arm A基因(0.93%,1/107)和rmt B基因(11.2%,12/107)阳性菌株,其中rmt B基因阳性株主要分布在山东省和江苏省,在辽宁省有一株同时携带arm A基因和rmt B基因的样品株。对107株虾源产ESBLs大肠杆菌的可移动原件进行检测,共检测到11种质粒型,以Inc FIIA质粒(52.3%,56/107)为主要类型,而且以同时携带两种质粒型为主(31.8%,34/107);同时,有77株携带Ⅰ型整合酶基因(72.0%,77/107),仅1株携带Ⅱ型整合酶基因(0.9%)。Ⅰ型整合酶阳性样品分离菌株中有34株可变区域内没有携带外源基因,43株(55.8%,43/77)可变区内携带耐药基因,以dfr A17-aad A5基因盒为主(32.6%,14/43),Ⅱ型整合酶阳性分离菌株携带drf A12-sat2-aad A1的基因盒。随机挑选57株携带bla CTX-M基因的分离菌株作为供体菌,以E.coli J53为受体菌,进行接合转移实验,结果发现有43株接合转移成功,接合转移发生率为75.4%(43/57),且接合子均携带bla CTX-M基因。而且大部分PMQR基因也都同时转移到了接合子中;另外,在部分接合子中还检测到16s r RNA甲基化转移酶、整合酶基因,说明这些基因可能都位于接合性质粒上,并且随着质粒与其他耐药基因共同转移、传播和扩散。本研究对采自山东、江苏、浙江、湖北和辽宁五个省份的克氏原鳌虾肠道内ESBLs大肠杆菌进行了分离鉴定、耐药基因筛选、可移动原件筛选及和接合转移等实验,获得了五个省份耐药大肠杆菌的流行病学本底,为克氏原螯虾细菌耐药性防控和水产品公共卫生监测奠定基础,也为水产食品安全检测提供理论依据。
【图文】：

图 3.1 大肠杆菌 16s rDNA 特异性 PCR 鉴定结果Fig. 3.1 The results of 16s rDNA specific identification to E.coli和 2：样品分离株；3：阳性对照；4：阴性对照；M：Marker DL2and 2, Isolates; 3, Positive control; 4, Negative control; M, Marker DL2

图 3.2 ESBLs 表型确认实验阳性Positive result of phenotypic confirmatory test for ESBLs 肠杆菌的药敏鉴定考 CLSI 耐药标准对 107 株虾源产 ESBLs 大肠
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S941.4

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本文编号：2654573