利用鱼类细胞系筛选抗神经坏死病毒（NNV）中草药的研究

发布时间：2020-05-18 11:15

【摘要】：石斑鱼广泛分布于热带和亚热带海域,是我国重要的海洋经济鱼类。然而在石斑鱼繁育生产过程中,病毒性神经坏死病(VNN)常引起石斑鱼仔稚鱼发生大规模死亡事件,死亡率常高达90%。VNN目前并没有有效的防治措施,而中草药具有低毒、无残留等优点,符合开发无公害渔药的特点,因此筛选抗神经坏死病毒(NNV)的中草药具有广阔的应用前景。在药物筛选的载体选择中,细胞系取自于生物体,生物性能基本接近生物个体特性,相比其他药物筛选载体,细胞系可进行高通量筛选,符合现代细胞生物学技术的发展趋势。故利用鱼类细胞系筛选抗NNV中草药具有一定的实践和理论价值。2013年5月份,山东省某繁育场培育的珍珠龙胆石斑鱼鱼苗由于感染了NNV而出现了大量死亡,给该繁育场带来了严重的经济损失。本论文对导致鱼苗患病死亡的病原进行了鉴定及测序分析,并利用健康珍珠龙胆石斑鱼的脑组织进行了细胞系建系工作,初步探讨了该细胞系与NNV的关系。在此基础上,又利用建立的脑组织PB细胞系和SSN-1细胞系进行了抗NNV中草药的筛选工作。本论文有如下主要研究结果:1疾病病原鉴定及基因测序分析该疾病暴发的主要流行病学特点为:患病珍珠龙胆石斑鱼体色发黑,厌食,死亡率达90%以上,具有一定的季节性。组织病理学实验表明患病鱼体脑组织、神经系统及视网膜组织出现大量的空泡化坏死病变。电镜切片观察到在神经组织中含有大量的20-30nm的病毒颗粒,呈晶格状排列在细胞质中。另外,使用世界动物卫生组织(OIE)推荐的检测NNV的PCR引物,成功的扩增出特异性条带(421bp)。结合该疾病的流行病学,患病鱼体的组织病理学,及分子生物学确诊了导致此次珍珠龙胆石斑鱼鱼苗患病死亡的病原体为NNV。在确定致病病原的基础上,利用四对引物成功的扩增出NNV含有的RNA1和RNA2的基因序列,并上传到Gen Bank中(获得的登陆号分别为:KF668184、KF668183),利用DNA star软件分析后表明此RNA1和RNA2的开放阅读框(ORF)分别编码982和338个氨基酸。其基因系统发育树分析表明该分离获取的NNV基因型属于RGNNV型。该基因型为我国内陆常见基因型,为后续的药物筛选提供了典型的病毒来源。2细胞系建立及对NNV的敏感性为了尽可能的排除不同来源病毒株在感染鱼体过程中的宿主特异性,本研究直接利用健康珍珠龙胆石斑鱼的脑组织进行细胞培养,并成功建系暂命名为PB细胞系。通过对PB细胞系生长条件(FBS含量、生长因子)的研究表明该细胞系在含有微量b FGF因子和10%FBS的1.5×L-15细胞培养液中贴壁生长良好。使用一定量的病毒粗提液添加到该细胞系后,虽然没有出现明显的细胞皱缩、变圆、脱落等典型的细胞病变(CPE),但细胞经Hoechst染色后,细胞核出现了一定程度的颗粒浓染现象,表明了病毒对该细胞系有一定的影响,细胞出现了轻微的退性病变,但表现在细胞总体上的CPE,并不明显。后续进行的相对荧光定量结果也表明了NNV在细胞中有一定的增殖。本试验成功建立的PB细胞系增加了现存有限鱼类细胞系的数量及种类,而NNV与PB细胞系之间的相互作用为研究病毒与宿主之间的关系提供了一定的理论参考。3抗NNV中草药的筛选通过查阅相关文献获得50种具有抗病毒作用的中草药,采取传统的煎煮法粗提制备,5倍稀释后,检测对SSN-1细胞系的大致安全浓度。在各中草药安全浓度下与一定量的病毒粗体液在4℃下混合处理24小时。加入SSN-1细胞系中,7天后观察SSN-1细胞系出现的CPE差异。利用CPE差异筛选出6种相对有效的中草药,分别对应的编号为H-15,H-22,H-27,H-33,H-37,H-45。此外,检测了H-15,H-22,H-27,H-33,H-37,H-45中草药对PB细胞系的安全浓度,并在安全浓度下与病毒粗提液混合处理作用于PB细胞系,用于NNV用药后在PB细胞中的相对荧光定量测定。结果表明,编号为H-15,H-22,H-27,H-33,H-37,H-45的中草药对NNV的增殖有一定的抑制作用。本部分研究结果为NNV引起的VNN的防控提供了一定的参考性药物,具有一定的实践生产意义。
【图文】：

鱼苗,石斑鱼,乙醇,二甲苯

图 2-1 患病石斑鱼鱼苗Figure 2-1 Infected grouper fingerlings.2 光镜样品处理方法取 10 尾症状典型的患病鱼苗和 10 尾正常鱼苗放入提前配好的 Davidison中固定。24 小时后，把固定的鱼苗置换到 70%乙醇中。随后，经过一系列于 Nikon E800 光学显微镜下进行正常鱼体及患病鱼体观察。处理程序如下in 70%乙醇，30 min 85%乙醇，20 min 95% 乙醇，30 min 95% 乙醇，20 min 1醇，30 min 100 % 乙醇脱水后，经 20 min 二甲苯，15min 二甲苯，15min处理后，放置于石蜡中进行透蜡。包埋、切片后进行染色。染色程序为：1甲苯，10 min 二甲苯，2 min 100% 乙醇，2 min 100% 乙醇，3 min 95% 乙 min 80% 乙醇，，2 min 80% 乙醇，2 min 50% 乙醇，2 min 蒸馏水，4:15 m精，8 min Wash 4，1min 伊红，10s Wash，2 min 95%乙醇，2min 95%乙醇，00%乙醇，3min 100%乙醇，2min 二甲苯，2min 二甲苯，2min 二甲苯。染

正常鱼,病鱼,体视,网膜

2.1 组织病理观察组织病理学观察发现，在患病石斑鱼鱼苗的大脑和视网膜组织中含有大量细胞空泡，且受感染的组织出现坏死、脱落现象。而在正常鱼体的脑和视网膜并未发现空泡和组织脱离现象，且各部分细胞间界限分明清晰（图 2-2）
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S948

【参考文献】