克氏原螯虾TNFAIP8基因的表达特征及功能分析
发布时间：2020-05-20 00:53
【摘要】：克氏原螯虾又称淡水小龙虾,在分类学上隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、螯虾科,是我国重要的淡水经济养殖虾品种。在很多地区已形成大规模养殖,但在高温季节尤其是集约化养殖水体中含有大量细菌和病毒很容易引发多种疾病,导致个体的死亡,对其经济收益造成了不利影响。先天免疫是无脊椎动物抵御病原微生物入侵的主要免疫方式,研究无脊椎动物的先天免疫对于阐明其免疫机制具有重要的理论意义,同时对提高其抗病能力及抗病育种具有一定的实践意义。TNFAIP8(tumor necrosis factorαinduced protein8)是一个包含有多种蛋白的蛋白质家族,与多种自身免疫性疾病、肿瘤等有关,参与了NF-κB、Toll等多个信号通路的调控。本研究旨在探讨TNFAIP8在克氏原螯虾免疫调节过程中的功能,取得的主要结果如下:1、本实验根据已有部分序列,设计特异性引物克隆了克氏原螯虾肿瘤坏死因子诱导蛋白8(TNFAIP8)基因的开放阅读框序列(ORF,open reading frame)。该序列长564 bp,编码187个氨基酸,预测的蛋白的理论分子量为21.4 kDa,等电点为9.038。进化树分析表明克氏原螯虾TNFAIP8基因与无脊椎动物TNFAIP8基因的亲缘关系最近。2、通过双酶切法构建了重组质粒PGEX-4T-3-Pc-TNFAIP8,转化大肠杆菌BL21后采用不同浓度的IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳和Western blot的检测结果表明克氏原螯虾TNFAIP8融合蛋白能够在原核表达系统中高效表达,获得的重组蛋白分子量大小为40 kDa左右,浓度约为1 mg/mL。3、利用GST Pull-down技术从克氏原螯虾血淋巴蛋白中筛选鉴定了一个与TNFAIP8相互作用的蛋白—血蓝蛋白(Hemocyanin)。4、提取克氏原螯虾血淋巴细胞、肠、鳃、胃、肝胰腺、肌肉、心脏7个不同组织RNA,通过荧光定量PCR法分析TNFAIP8基因在不同组织中的表达分布情况,结果表明其在各个组织中均表达,其中在血淋巴细胞中的表达量最高,其次为鳃和肠。5、LPS和PolyI:C刺激后克氏原螯虾血淋巴细胞、鳃、肠中TNFAIP8基因的表达量显著降低,而TNFAIP8重组蛋白诱导和TNFAIP8基因的siRNA干扰处理能够显著影响Toll、Serpin、Bcl、Lectin、TNF等相关免疫基因及Hemocyanin在血淋巴细胞及腮中的表达。综上所述,TNFAIP8基因在克氏原螯虾免疫反应中具有一定的功能。
【图文】：
4.1 总 RNA 的检测提取的克氏原螯虾总 RNA 用1%的琼脂糖胶160 V恒压电泳10-15 min，通过电泳检测及纯度检测表明：总 RNA 的 A260/A280 数值均在2.0左右，如图4-1可以看到清晰的28S 和18S 两条带，没有明显拖尾现象，可用于后续实验。图4-1 克氏原螯虾总RNA电泳图Fig. 4-1 1.0％agrose gel electrophoresis of Procambarus clarkii total RNA4.2 TNFAIP8 基因序列分析生物信息学分析表明 TNFAIP8 基因的开放阅读框序列全长为564 bp，编码的蛋白质含有187个氨基酸残基，预测的成熟蛋白理论分子量为21.4 kDa，其等电点为9.038。将克氏原螯虾 TNFAIP8 蛋白与脊椎动物及无脊椎动物进行进化树分析，结果表明，克氏原螯虾 TNFAIP8 蛋白与无脊椎动物的TNFAIP8蛋白亲缘关系更近。见图4-2。A
B图 4-2 TNFAIP8 基因序列分析（A）和氨基酸序列进化树分析（B）Fig.4-2 Sequence analysis and phylogenetic analysis of PC-TNFAIP8.Fig 4-2 A 起始密码子 ATG 用方框表示，终止密码子 TGA 用*表示。B 克氏原螯虾 TNFAIP8 氨基酸序列进化树分析，用于构建进化树的 TNFAIP8 的物种及序列号为：白蚁（KDR15042.1），温带臭虫（XP_014259819.1），肩突硬蜱（XP_002411876.1），三角河蚌（AHN82531.1），，牡蛎（XP_011417194.1），赤拟谷盗（XP_015838848.1），美洲鲎（XP_013776311.1）亚洲龙鱼（KPP59962.1），原鸡（XP-015136101.1），家鼠（NP_001171230.1）人（NP_689575.2），密西西比鳄（KYO42541.1），斑马鱼（NP_956626.1）。Fig 4-2 A.Initiation codon ATG is boxed，and termination codon TAG marked with *. B.Phylogenetic analysis wasperformed by MEGA program based on the TNFAIP8 amino acid sequences from various animals. The phylogenetic treewas constructed using the neighbor-joining algorithm method and bootstrap values (1000 repetitions) of the branches areindicated. The origins and accession numbers of the TNFAIP8 sequences are: Zootermopsis nevadensis, KDR15042.1;Cimex lectularius,XP_014259819.1;Ixodes scapularis, XP_002411876.1;Hyriopsis cumingii, AHN82531.1 ; Crassostrea gigas, XP_011417194.1; Tribolium castaneum, XP_015838848.1;Gallus galluss, XP-0151 36101.1;Mus musculus,NP_001171230.1;Homo sapiens, NP_689575.2;Alligator mississippiensis, KYO42541.1; Scleropages formosus, KPP59
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4;Q78
本文编号：2671751
【图文】：
4.1 总 RNA 的检测提取的克氏原螯虾总 RNA 用1%的琼脂糖胶160 V恒压电泳10-15 min，通过电泳检测及纯度检测表明：总 RNA 的 A260/A280 数值均在2.0左右，如图4-1可以看到清晰的28S 和18S 两条带，没有明显拖尾现象，可用于后续实验。图4-1 克氏原螯虾总RNA电泳图Fig. 4-1 1.0％agrose gel electrophoresis of Procambarus clarkii total RNA4.2 TNFAIP8 基因序列分析生物信息学分析表明 TNFAIP8 基因的开放阅读框序列全长为564 bp，编码的蛋白质含有187个氨基酸残基，预测的成熟蛋白理论分子量为21.4 kDa，其等电点为9.038。将克氏原螯虾 TNFAIP8 蛋白与脊椎动物及无脊椎动物进行进化树分析，结果表明，克氏原螯虾 TNFAIP8 蛋白与无脊椎动物的TNFAIP8蛋白亲缘关系更近。见图4-2。A
B图 4-2 TNFAIP8 基因序列分析（A）和氨基酸序列进化树分析（B）Fig.4-2 Sequence analysis and phylogenetic analysis of PC-TNFAIP8.Fig 4-2 A 起始密码子 ATG 用方框表示，终止密码子 TGA 用*表示。B 克氏原螯虾 TNFAIP8 氨基酸序列进化树分析，用于构建进化树的 TNFAIP8 的物种及序列号为：白蚁（KDR15042.1），温带臭虫（XP_014259819.1），肩突硬蜱（XP_002411876.1），三角河蚌（AHN82531.1），，牡蛎（XP_011417194.1），赤拟谷盗（XP_015838848.1），美洲鲎（XP_013776311.1）亚洲龙鱼（KPP59962.1），原鸡（XP-015136101.1），家鼠（NP_001171230.1）人（NP_689575.2），密西西比鳄（KYO42541.1），斑马鱼（NP_956626.1）。Fig 4-2 A.Initiation codon ATG is boxed，and termination codon TAG marked with *. B.Phylogenetic analysis wasperformed by MEGA program based on the TNFAIP8 amino acid sequences from various animals. The phylogenetic treewas constructed using the neighbor-joining algorithm method and bootstrap values (1000 repetitions) of the branches areindicated. The origins and accession numbers of the TNFAIP8 sequences are: Zootermopsis nevadensis, KDR15042.1;Cimex lectularius,XP_014259819.1;Ixodes scapularis, XP_002411876.1;Hyriopsis cumingii, AHN82531.1 ; Crassostrea gigas, XP_011417194.1; Tribolium castaneum, XP_015838848.1;Gallus galluss, XP-0151 36101.1;Mus musculus,NP_001171230.1;Homo sapiens, NP_689575.2;Alligator mississippiensis, KYO42541.1; Scleropages formosus, KPP59
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4;Q78
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