家蚕杆状病毒表达系统研制草鱼出血病病毒和禽流感病毒疫苗
发布时间：2022-12-05 21:05
杆状病毒表达系统作为一个功能强大的表达载体已被广泛地应用于昆虫细胞中重组蛋白的表达及亚单位疫苗的开发，在哺乳动物细胞中，杆状病毒不能进行复制和转录，具较强安全性。含有非昆虫细胞的启动子（如CMV的启动子）的重组杆状病毒，可以有效地传递外源基因导入非昆虫细胞并实现外源基因高效表达。 1．草鱼出血病病毒GCRV VP7蛋白亚单位/VP6DNA联合口服疫苗的制备及免疫效果评价 将团头鲂（Megalobrama amblycephala）的β-肌动蛋白启动子控制的VP6蛋白基因克隆进杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中，同时将GCRV的另一结构蛋白VP7基因置于杆状病毒多角体蛋白（polh）基因启动子控制之下，构建双启动子控制双结构基因的蛋白—核酸疫苗表达载体pFastTMDual-VP7-VP6-β-actin，并获得重组杆状病毒Bacmid-VP7-VP6-β-actin，与刘林基于vp6单基因、徐诗英基于vp7单基因的蛋白/核酸联合口服疫苗不同，期望研制出能够高效对抗GCRV的草鱼疫苗。 本研究利用杆状病毒表达系统在家蚕卵巢细胞及蚕蛹中进行GCRV结构蛋白VP...
【文章页数】：109 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一部分 文献综述
第一章 草鱼呼肠孤病毒相关研究
1.1 草鱼出血病病毒的基因结构
1.2 GCRV 编码的蛋白及功能
1.2.1 抗原性
1.2.2 病毒感染特性
1.3 呼肠孤病毒的细胞毒性
1.4 草鱼出血病的检测
1.5 草鱼出血病的防治
参考文献
第二章 禽流感相关研究
2.1 禽流感病毒基因组
2.2 AIV 基因组编码的蛋白与功能
2.3 流感病毒的遗传变异
2.4 禽流感疫苗的研究进展
2.4.1 全病毒灭活疫苗
2.4.2 亚单位疫苗
2.4.3 重组活载体疫苗
2.4.4 核酸疫苗
2.4.5 抗原表位疫苗
参考文献
第二部分 研究报告
第三章 研究目的和研究内容
3.1 研究目的和意义
3.2 研究内容
3.2.1 草鱼出血病主要研究内容
3.2.2 禽流感多表位疫苗研究内容
3.2.3 草鱼出血病疫苗研制的主要研究技术路线
3.2.4 禽流感多表位疫苗的主要研究技术路线
参考文献
第四章 vp7、vp6 原核表达及多克隆抗体的制备
摘要
1 实验材料
1.1 生物材料
1.2 实验试剂
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 vp7 基因、vp6 基因、β-actin 启动子的克隆
2.2 vp7、vp6、基因及β-actin 启动子的 T 载体克隆与鉴定
2.3 pET28a(+)-VP7、pET28a(+)-VP6 表达载体的构建
2.4 重组载体 pET28a(+)-VP7 及 pET28a(+)-VP6 的诱导表达
2.5 VP7、VP6 蛋白的 SDS-PAGE 分析
2.6 VP7、VP6 蛋白的 Western blotting 分析
2.7 VP7、VP6 多克隆抗体的制备
3 实验结果
3.1 vp7、vp6 基因及β-actin 基因启动子扩增的结果
3.2 vp7、vp6 基因及β-actin 的 T 载体克隆结果
3.3 表达载体 pET28a(+)-VP7 的鉴定
3.4 重组 VP7、VP6 蛋白的鉴定
3.5 多克隆抗体的检测
4 讨论
参考文献
第五章 GCRV VP7 蛋白亚单位/vp6 DNA 联合口服疫苗的制备及免疫效果评价
摘要
1 实验材料
1.1 生物材料
1.2 实验试剂
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 重组供体质粒的构建
2.2 重组 Bacmid 的获得
2.3 重组病毒的获得
2.4 重组蛋白的表达检测
2.5 CIK 细胞的培养
2.6 重组病毒接种 CIK 细胞及 VP6 抗原表达的检测
2.7 疫苗的制备
2.8 疫苗口服免疫鱼体
2.10 RT-PCR 检测免疫鱼体中 vp6 基因的表达
2.11 组织免疫荧光
3 结果与分析
3.1 重组转移载体 pFastTM-Dual-VP7-VP6-β-actin 的鉴定
3.2 重组病毒 Bacmid-VP7-VP6-β-actin 的产生及鉴定
3.3 重组病毒的获得及鉴定
3.4 重组蛋白的表达检测
3.5 转染重组病毒的 CIK 细胞中表达 VP6 抗原的检测
3.6 口服免疫后鱼血中 vp6 mRNA 的检测
3.7 免疫荧光检测免疫草鱼组织中 VP6 蛋白
4 讨论
参考文献
第六章 禽流感多抗原表位在家蚕中的表达
摘要
1 实验材料
1.1 生物材料
1.2 实验试剂
2 实验方法
2.1 CTL T 细胞表位盒核苷酸序列
2.2 Th 及 B 细胞表位盒核苷酸序列
2.3 重组质粒的构建
2.4 重组 Bacmid 的获得
2.5 重组杆状病毒的获得
2.6 CTLT 抗原表位及 THB 抗原表位表达与鉴定
3 结果与分析
3.1 供体质粒的鉴定
3.2 重组 Bacmid 的获得
3.3 重组杆状病毒的获得
3.4 表位抗原表达检测
4 讨论
参考文献
结论
1 已取得的成果
2 有待进行的研究
公开发表学术论文
附录一：缩略词表
1.常规缩略词表
2.专业词汇缩略词表
附录二：部分质粒图谱
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪瘟病毒糖基化E2蛋白在重组杆状病毒中的表达与鉴定[J]. 李文良,毛立,张纹纹,杨蕾蕾,王小敏,江杰元. 江苏农业学报. 2013(02)
[2]Antigenic analysis of grass carp reovirus using single-chain variable fragment antibody against IgM from Ctenopharyngodon idella[J]. CHEN CongLin,SUN XiaoYun,LIAO LanJie,LUO ShaoXiang,LI ZhouQuan,ZHANG XiaoHua,WANG YaPing,GUO QionLin,FANG Qin,DAI HePing. Science China（Life Sciences）. 2013(01)
[3]草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估[J]. 刘林,徐诗英,李婧慧,邹勇,倪金俤,杨鸢劼,曹广力,薛仁宇,陈辉,贡成良. 中国水产科学. 2012(05)
[4]禽流感病毒H5亚型HA基因在杆状病毒系统中的表达及生物学活性鉴定[J]. 赵双成,常晓飞,田石,柳金雄,陈普成,田国彬,邓国华,姜永萍,陈化兰. 中国预防兽医学报. 2012(07)
[5]草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J]. 王晓丰,薛晖,丁正峰,唐建清,夏爱军. 浙江农业学报. 2012(02)
[6]草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用[J]. 刘宝芹,曾伟伟,王庆,张乐生,王英英,石存斌,吴淑勤. 中国水产科学. 2012(02)
[7]草鱼呼肠孤病毒RT-LAMP检测方法的建立[J]. 李玉平,任宪刚,毛洪顺,张宏伟. 畜牧兽医科技信息. 2012(01)
[8]小发夹RNA在稀有鮈鲫胚胎中的表达[J]. 杨琳,汪亚平,廖兰杰,朱作言. 水生生物学报. 2010(05)
[9]H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗株组织嗜性的研究[J]. 董俊斌,步志高. 江西农业大学学报. 2010(04)
[10]草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白VP7基因真核表达载体pCI-VP7的构建及鉴定[J]. 郝贵杰,潘晓艺,姚嘉赟,徐洋,尹文林,沈锦玉. 水产学报. 2010(05)
本文编号：3710349
【文章页数】：109 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一部分 文献综述
第一章 草鱼呼肠孤病毒相关研究
1.1 草鱼出血病病毒的基因结构
1.2 GCRV 编码的蛋白及功能
1.2.1 抗原性
1.2.2 病毒感染特性
1.3 呼肠孤病毒的细胞毒性
1.4 草鱼出血病的检测
1.5 草鱼出血病的防治
参考文献
第二章 禽流感相关研究
2.1 禽流感病毒基因组
2.2 AIV 基因组编码的蛋白与功能
2.3 流感病毒的遗传变异
2.4 禽流感疫苗的研究进展
2.4.1 全病毒灭活疫苗
2.4.2 亚单位疫苗
2.4.3 重组活载体疫苗
2.4.4 核酸疫苗
2.4.5 抗原表位疫苗
参考文献
第二部分 研究报告
第三章 研究目的和研究内容
3.1 研究目的和意义
3.2 研究内容
3.2.1 草鱼出血病主要研究内容
3.2.2 禽流感多表位疫苗研究内容
3.2.3 草鱼出血病疫苗研制的主要研究技术路线
3.2.4 禽流感多表位疫苗的主要研究技术路线
参考文献
第四章 vp7、vp6 原核表达及多克隆抗体的制备
摘要
1 实验材料
1.1 生物材料
1.2 实验试剂
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 vp7 基因、vp6 基因、β-actin 启动子的克隆
2.2 vp7、vp6、基因及β-actin 启动子的 T 载体克隆与鉴定
2.3 pET28a(+)-VP7、pET28a(+)-VP6 表达载体的构建
2.4 重组载体 pET28a(+)-VP7 及 pET28a(+)-VP6 的诱导表达
2.5 VP7、VP6 蛋白的 SDS-PAGE 分析
2.6 VP7、VP6 蛋白的 Western blotting 分析
2.7 VP7、VP6 多克隆抗体的制备
3 实验结果
3.1 vp7、vp6 基因及β-actin 基因启动子扩增的结果
3.2 vp7、vp6 基因及β-actin 的 T 载体克隆结果
3.3 表达载体 pET28a(+)-VP7 的鉴定
3.4 重组 VP7、VP6 蛋白的鉴定
3.5 多克隆抗体的检测
4 讨论
参考文献
第五章 GCRV VP7 蛋白亚单位/vp6 DNA 联合口服疫苗的制备及免疫效果评价
摘要
1 实验材料
1.1 生物材料
1.2 实验试剂
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 重组供体质粒的构建
2.2 重组 Bacmid 的获得
2.3 重组病毒的获得
2.4 重组蛋白的表达检测
2.5 CIK 细胞的培养
2.6 重组病毒接种 CIK 细胞及 VP6 抗原表达的检测
2.7 疫苗的制备
2.8 疫苗口服免疫鱼体
2.10 RT-PCR 检测免疫鱼体中 vp6 基因的表达
2.11 组织免疫荧光
3 结果与分析
3.1 重组转移载体 pFastTM-Dual-VP7-VP6-β-actin 的鉴定
3.2 重组病毒 Bacmid-VP7-VP6-β-actin 的产生及鉴定
3.3 重组病毒的获得及鉴定
3.4 重组蛋白的表达检测
3.5 转染重组病毒的 CIK 细胞中表达 VP6 抗原的检测
3.6 口服免疫后鱼血中 vp6 mRNA 的检测
3.7 免疫荧光检测免疫草鱼组织中 VP6 蛋白
4 讨论
参考文献
第六章 禽流感多抗原表位在家蚕中的表达
摘要
1 实验材料
1.1 生物材料
1.2 实验试剂
2 实验方法
2.1 CTL T 细胞表位盒核苷酸序列
2.2 Th 及 B 细胞表位盒核苷酸序列
2.3 重组质粒的构建
2.4 重组 Bacmid 的获得
2.5 重组杆状病毒的获得
2.6 CTLT 抗原表位及 THB 抗原表位表达与鉴定
3 结果与分析
3.1 供体质粒的鉴定
3.2 重组 Bacmid 的获得
3.3 重组杆状病毒的获得
3.4 表位抗原表达检测
4 讨论
参考文献
结论
1 已取得的成果
2 有待进行的研究
公开发表学术论文
附录一：缩略词表
1.常规缩略词表
2.专业词汇缩略词表
附录二：部分质粒图谱
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪瘟病毒糖基化E2蛋白在重组杆状病毒中的表达与鉴定[J]. 李文良,毛立,张纹纹,杨蕾蕾,王小敏,江杰元. 江苏农业学报. 2013(02)
[2]Antigenic analysis of grass carp reovirus using single-chain variable fragment antibody against IgM from Ctenopharyngodon idella[J]. CHEN CongLin,SUN XiaoYun,LIAO LanJie,LUO ShaoXiang,LI ZhouQuan,ZHANG XiaoHua,WANG YaPing,GUO QionLin,FANG Qin,DAI HePing. Science China（Life Sciences）. 2013(01)
[3]草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估[J]. 刘林,徐诗英,李婧慧,邹勇,倪金俤,杨鸢劼,曹广力,薛仁宇,陈辉,贡成良. 中国水产科学. 2012(05)
[4]禽流感病毒H5亚型HA基因在杆状病毒系统中的表达及生物学活性鉴定[J]. 赵双成,常晓飞,田石,柳金雄,陈普成,田国彬,邓国华,姜永萍,陈化兰. 中国预防兽医学报. 2012(07)
[5]草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J]. 王晓丰,薛晖,丁正峰,唐建清,夏爱军. 浙江农业学报. 2012(02)
[6]草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用[J]. 刘宝芹,曾伟伟,王庆,张乐生,王英英,石存斌,吴淑勤. 中国水产科学. 2012(02)
[7]草鱼呼肠孤病毒RT-LAMP检测方法的建立[J]. 李玉平,任宪刚,毛洪顺,张宏伟. 畜牧兽医科技信息. 2012(01)
[8]小发夹RNA在稀有鮈鲫胚胎中的表达[J]. 杨琳,汪亚平,廖兰杰,朱作言. 水生生物学报. 2010(05)
[9]H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗株组织嗜性的研究[J]. 董俊斌,步志高. 江西农业大学学报. 2010(04)
[10]草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白VP7基因真核表达载体pCI-VP7的构建及鉴定[J]. 郝贵杰,潘晓艺,姚嘉赟,徐洋,尹文林,沈锦玉. 水产学报. 2010(05)
本文编号：3710349
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