杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡转运型细菌毒力因子的筛选及初步功能研究
发布时间：2023-11-24 19:30
细菌外膜囊泡是革兰氏阴细菌分泌的脂双层球状小泡,它能够携带多种细菌毒力因子,将其转运到细菌胞外,或者进一步转运到宿主细胞中。因此,细菌外膜囊泡被认为是一种细菌转运毒力因子的重要方式。杀鱼爱德华氏菌是一种重要的鱼类病原菌,它在感染过程中,能够通过多种分泌系统将细菌毒力因子转运到宿主细胞内,干扰宿主的免疫防御系统,从而实现细菌的胞内感染和致病过程。为了探究杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡与细菌毒力因子转运的关系,本课题建立了杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡的提取工艺,筛选并鉴定了多个外膜囊泡转运型细菌蛋白因子,并进一步探讨了杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡的细胞内化机制及细菌毒力因子溶血素对其内化、胞内小泡运输及免疫识别的影响。具体内容包括:首先,通过超滤浓缩和密度梯度离心的方法建立了杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡的提取工艺,通过电镜观察了纯化外膜囊泡的形貌特征,考察了杀鱼爱德华氏菌在生长过程中产生外膜囊泡的时相变化,并通过SDS-PAGE初步分析了杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡的蛋白组分谱;接着,利用质谱技术对杀鱼爱德华氏菌的外膜囊泡蛋白进行了蛋白组分分析,鉴定获得了包括T3SS组件、T6SS组件、细菌铁摄取系统组件、溶血素等在内的...
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 细菌的分泌系统
1.2 细菌的外膜囊泡
1.2.1 外膜囊泡的结构
1.2.2 外膜囊泡的生物合成机制
1.2.3 外膜囊泡的基本生物学功能
1.3 细菌外膜囊泡分泌的毒力因子
1.4 细菌外膜囊泡转运不同毒力因子的鉴定方法
1.4.1 质谱分析法
1.4.2 免疫印迹法
1.4.3 免疫电镜法
1.5 细菌外膜囊泡的内吞途径和胞内运输
1.5.1 细菌外膜囊泡进入宿主细胞的途径
1.5.2 细菌外膜囊泡在胞内的运输
1.6 本课题的研究内容及意义
第2章 杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡的提取与分析
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌株
2.2.2 药品与试剂
2.2.3 培养基
2.2.4 仪器与技术服务
2.3 实验方法
2.3.1 外膜囊泡的提取
2.3.2 Bradford法测定外膜囊泡的蛋白浓度
2.3.3 电镜观察外膜囊泡
2.3.4 外膜囊泡产生的动力学
2.3.5 外膜囊泡的蛋白组分分析
2.4 实验结果
2.4.1 外膜囊泡电镜观察
2.4.2 密度梯度离心后外膜囊泡检测
2.4.3 外膜囊泡产生动力学
2.4.4 外膜囊泡的蛋白组分谱分析
2.5 讨论
2.6 本章小结
第3章 杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡分泌型细菌毒力因子的筛选
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 菌株与培养基
3.2.2 药品与试剂
3.2.3 仪器与技术服务
3.3 实验方法
3.3.1 质谱分析实验
3.3.2 外膜囊泡分泌毒力因子免疫印迹筛选
3.3.3 免疫印迹实验方法
3.4 实验结果
3.4.1 通过质谱法分析外膜囊泡所携带的细菌毒力因子
3.4.2 从胞内转运的效应物中筛选依赖外膜囊泡传递的毒力因子
3.5 讨论
3.6 本章小结
第4章 杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡内吞途径及胞内运输
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 菌株,细胞及培养基
4.2.2 药品与试剂
4.2.3 仪器设备
4.3 实验方法
4.3.1 外膜囊泡内化免疫荧光实验
4.3.2 外膜囊泡内吞抑制剂处理实验
4.3.3 外膜囊泡定位分析免疫荧光实验
4.4 实验结果
4.4.1 外膜囊泡随时间的内化过程
4.4.2 外膜囊泡依赖dynamin的内吞方式
4.4.3 外膜囊泡在细胞内的小泡运输
4.5 讨论
4.6 本章小结
第5章 溶血素对杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡胞内运输过程的影响
5.1 引言
5.2 实验材料
5.3 实验方法
5.3.1 溶血素过表达株免疫印迹和溶血活性鉴定实验
5.3.2 蛋白酶K处理外膜囊泡的实验
5.3.3 免疫荧光分析溶血素对外膜囊泡的内化及胞内运输实验
5.3.4 细胞内LPS的检测
5.3.5 细胞毒性LDH检测
5.4 实验结果
5.4.1 溶血素过表达菌株的鉴定
5.4.2 溶血素在外膜囊泡中的定位
5.4.3 溶血素对外膜囊泡内化的影响
5.4.4 溶血素对外膜囊泡胞内运输的影响
5.4.5 溶血素促进宿主caspase-4受体识别外膜囊泡中的LPS
5.5 讨论
5.6 本章小结
第6章 结论与展望
6.1 结论
6.2 展望
参考文献
论文发表
致谢
本文编号：3866449
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
1.1 细菌的分泌系统
1.2 细菌的外膜囊泡
1.2.1 外膜囊泡的结构
1.2.2 外膜囊泡的生物合成机制
1.2.3 外膜囊泡的基本生物学功能
1.3 细菌外膜囊泡分泌的毒力因子
1.4 细菌外膜囊泡转运不同毒力因子的鉴定方法
1.4.1 质谱分析法
1.4.2 免疫印迹法
1.4.3 免疫电镜法
1.5 细菌外膜囊泡的内吞途径和胞内运输
1.5.1 细菌外膜囊泡进入宿主细胞的途径
1.5.2 细菌外膜囊泡在胞内的运输
1.6 本课题的研究内容及意义
第2章 杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡的提取与分析
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌株
2.2.2 药品与试剂
2.2.3 培养基
2.2.4 仪器与技术服务
2.3 实验方法
2.3.1 外膜囊泡的提取
2.3.2 Bradford法测定外膜囊泡的蛋白浓度
2.3.3 电镜观察外膜囊泡
2.3.4 外膜囊泡产生的动力学
2.3.5 外膜囊泡的蛋白组分分析
2.4 实验结果
2.4.1 外膜囊泡电镜观察
2.4.2 密度梯度离心后外膜囊泡检测
2.4.3 外膜囊泡产生动力学
2.4.4 外膜囊泡的蛋白组分谱分析
2.5 讨论
2.6 本章小结
第3章 杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡分泌型细菌毒力因子的筛选
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 菌株与培养基
3.2.2 药品与试剂
3.2.3 仪器与技术服务
3.3 实验方法
3.3.1 质谱分析实验
3.3.2 外膜囊泡分泌毒力因子免疫印迹筛选
3.3.3 免疫印迹实验方法
3.4 实验结果
3.4.1 通过质谱法分析外膜囊泡所携带的细菌毒力因子
3.4.2 从胞内转运的效应物中筛选依赖外膜囊泡传递的毒力因子
3.5 讨论
3.6 本章小结
第4章 杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡内吞途径及胞内运输
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 菌株,细胞及培养基
4.2.2 药品与试剂
4.2.3 仪器设备
4.3 实验方法
4.3.1 外膜囊泡内化免疫荧光实验
4.3.2 外膜囊泡内吞抑制剂处理实验
4.3.3 外膜囊泡定位分析免疫荧光实验
4.4 实验结果
4.4.1 外膜囊泡随时间的内化过程
4.4.2 外膜囊泡依赖dynamin的内吞方式
4.4.3 外膜囊泡在细胞内的小泡运输
4.5 讨论
4.6 本章小结
第5章 溶血素对杀鱼爱德华氏菌外膜囊泡胞内运输过程的影响
5.1 引言
5.2 实验材料
5.3 实验方法
5.3.1 溶血素过表达株免疫印迹和溶血活性鉴定实验
5.3.2 蛋白酶K处理外膜囊泡的实验
5.3.3 免疫荧光分析溶血素对外膜囊泡的内化及胞内运输实验
5.3.4 细胞内LPS的检测
5.3.5 细胞毒性LDH检测
5.4 实验结果
5.4.1 溶血素过表达菌株的鉴定
5.4.2 溶血素在外膜囊泡中的定位
5.4.3 溶血素对外膜囊泡内化的影响
5.4.4 溶血素对外膜囊泡胞内运输的影响
5.4.5 溶血素促进宿主caspase-4受体识别外膜囊泡中的LPS
5.5 讨论
5.6 本章小结
第6章 结论与展望
6.1 结论
6.2 展望
参考文献
论文发表
致谢
本文编号：3866449
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