马氏珠母贝外套膜不同区域差异microRNA的筛选和功能研究

发布时间：2024-01-25 19:43

　　外套膜是贝壳形成的重要器官,按照不同部位结构特征和功能的不同,外套膜从壳顶向壳低方向大致可以分为三个区域:边缘膜区(marginal zone)、套膜区(pallial zone)、中央膜区(central zone)。一般认为,边缘膜区主要参与棱柱层的形成,套膜区和中央膜区主要参与珍珠层的形成。为了探究外套膜中央膜与边缘膜功能上的差异机制,课题组前期的研究中构建了马氏珠母贝中央膜与边缘膜mRNA和miRNA转录组数据库,本研究以此为基础,筛选中央膜和边缘膜差异表达的miRNA,随后通过mir-RACE技术验证筛选miRNA的序列,利用茎环引物荧光定量技术检测筛选miRNA的组织表达差异。通过生物信息学分析筛选miRNA的靶点,并使用双荧光素酶实验验证miRNA与预测靶基因间的靶向关系。最后通过体内miRNA过表达实验,结合茎环引物荧光定量和扫描电镜观察,检测mi RNA对贝壳内表面结构及靶基因表达的影响,以此鉴定miRNA的功能及调控机制。主要研究结果如下:1.miRNA的筛选和鉴定:通过分析马氏珠母贝外套膜中央膜与边缘膜miRNA数据,从189条已知miRNA中分别筛选出3个边缘膜...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 马氏珠母贝简介
        1.1.1 贝壳形成相关的生物矿化研究
        1.1.2 外套膜的结构
    1.2 miRNA简介
        1.2.1 miRNA的发现
        1.2.2 miRNA的生物学特点
        1.2.3 miRNA的生物合成
        1.2.4 miRNA的作用机制
        1.2.5 miRNA的研究方法
    1.3 研究目的和意义
2 马氏珠母贝外套膜miRNA的筛选和验证
    2.1 实验方法
        2.1.1 中央膜和边缘膜差异miRNA的筛选
        2.1.2 实验用贝
        2.1.3 质粒、载体和细胞
        2.1.4 实验所需引物
        2.1.5 主要试剂及设备
        2.1.6 实验所需主要溶液、试剂配制方法
        2.1.7 miRNA的提取
        2.1.8 mir-RACE获得mi RNA序列
        2.1.9 miRNA边缘膜中央膜组织差异表达分析
    2.2 结果与分析
        2.2.1 筛选结果
        2.2.2 mir-RACE模板与克隆条带分析
        2.2.3 miRNA荧光定量结果分析
    2.3 讨论
3 miRNA功能的研究
    3.1 实验步骤
    3.2 实验结果
        3.2.1 荧光定量结果
        3.2.2 SEM观察miRNA过表达效果
    3.3 讨论
        3.3.1 miRNA对贝壳形成的影响
4 马氏珠母贝外套膜miRNA靶点筛选和靶向关系验证
    4.1 实验方法
        4.1.1 靶点的筛选
        4.1.2 靶基因目的片段载体的构建
        4.1.3 靶位点突变载体的构建
        4.1.4 双荧光素酶系统实验验证miRNA对靶点的调控
        4.1.5 荧光定量检测靶基因的表达量
        4.1.6 NPY序列验证
        4.1.7 miRNA过表达对靶基因的影响
    4.2 结果与分析
        4.2.1 靶点的筛选
        4.2.2 miRNA过表达对靶基因的影响
        4.2.3 目的片段载体构建结果
        4.2.4 双荧光素酶实验
    4.3 讨论
        4.3.1 miRNA靶点的筛选
        4.3.2 miRNA对贝类矿化的影响
        4.3.3 miRNA对贝类免疫的影响
5 结论
参考文献
致谢
作者简介
导师简介



本文编号：3885443