脂多糖和β-1,3-葡聚糖结合蛋白（LGBP）激活中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）酚氧化酶原系统的研究

发布时间：2024-03-12 01:10

　　由酚氧化酶原激活系统调控的黑化作用在无脊椎动物防御病原微生物入侵机体的过程中起到了重要作用。脂多糖和β-1,3-葡聚糖结合蛋白(LGBP)作为一种模式识别蛋白(PRP),已经在昆虫和虾中证实能够激活酚氧化酶原系统。基于此,我们探究LGBP在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)这一重要的经济水产中是否同样能够激活酚氧化酶原系统引发黑化作用等免疫反应。通过定量PCR分析,发现LGBP基因在检测的所有组织中都表达,并且在血细胞、鳃、肠和脑中表达量更高。当LPS和β-1,3-葡聚糖体内攻毒中华绒螯蟹12 h时,血细胞中LGBP的表达量明显升高。通过原核表达技术和亲和层析获得了重组LGBP蛋白(rEsLGBP)。通过蛋白免疫印迹实验,发现rEsLGBP能够结合所有的检测菌(包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌),同时发现该蛋白可以与LPS和β-1,3-葡聚糖这两类病原相关分子模式(PAMP)结合而不与肽聚糖结合。将LGBP孵育的琼脂糖镍珠加入到血淋巴中,观察到了明显的血细胞脱颗粒现象以及对镍珠的包裹作用。随后,证实了1EsLGBP能够诱导全血依赖的黑化作用并且验证了不同血淋巴组分对...

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
内容摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    第一节 无脊椎动物先天免疫概述
        1.1 引言
        1.2 细胞免疫
        1.3 体液免疫
    第二节 无脊椎动物酚氧化酶级联反应概述
        2.1 引言
        2.2 酚氧化酶级联反应的组成
        2.3 酚氧化酶原级联反应的激活
        2.4 酚氧化酶原级联反应的调控
    第三节 本研究的意义及技术路线
第二章 LGBP基因表达模式分析
    第一节 前言
    第二节 材料与方法
        2.1 中华绒螯蟹体内PAMP免疫注射、样品收集
        2.2 EsLGBP的组织表达检测
        2.3 三种PAMP免疫刺激后EsLGBP的诱导表达检测
    第三节 结果
        3.1 EsLGBP的组织表达分析
        3.2 三种PAMP免疫刺激后EsLGBP的诱导表达模式分析
    第四节 讨论
第三章 rEsLGBP参与酚氧化酶原激活系统等免疫反应研究
    第一节 前言
    第二节 材料与方法
        2.1 重组rEsLGBP表达载体的构建
        2.2 EsLGBP重组蛋白的表达、纯化并复性
        2.3 r EsLGBP与不同病原菌及PAMP结合实验
        2.4 蛋白印迹检测
        2.5 r EsLGBP的血细胞调理活性检测(包裹作用)
        2.6 r EsLGBP诱导黑化作用的检测
        2.7 E-GBP影响酚氧化酶酶活性的检测
    第三节 结果
        3.1 重组r EsLGBP的分析
        3.2 重组r EsLGBP与微生物和病原模式分子结合活性分析
        3.3 重组r EsLGBP的血细胞调理活性分析
        3.4 重组r EsLGBP诱导黑化作用的分析
        3.5 重组r EsLGBP对酚氧化酶酶活性的影响
    第四节 讨论
第四章 EsLGBP体外干扰后,酚氧化酶原激活系统相关基因表达量的检测
    第一节 前言
    第二节 材料与方法
        2.1 中华绒螯蟹原代血细胞的培养
        2.2 EsLGBP的体外干扰
        2.3 EsLGBP干扰后对PO-AS相关基因的检测
    第三节 结果
        3.1 干扰效果检测
        3.2 干扰LGBP后,酚氧化酶原激活系统相关基因表达量的检测
    第四节 讨论
第五章 总结与展望
参考文献
附录
致谢



本文编号：3926306