蛤仔（Ruditapes philippinarum）噬菌体型溶菌酶基因的克隆及表达分析
发布时间：2024-03-26 01:15
蛤仔广泛养殖于欧洲和亚洲海域，是我国重要的海水养殖经济贝类。然而，随着近年来的扩大生产和环境恶化，以及各类微生物引起的蛤仔疾病，严重威胁到了蛤仔养殖产业的健康和可持续发展。因此，更好地了解蛤仔免疫反应机制可以为蛤仔健康管理与养殖已经病害的防治提供新的方向。 与其他无脊椎动物相同，蛤仔非特异性免疫因子在抵抗外来病原的入侵中起重要作用。而生物体内的溶菌酶在先天性免疫中起到了举足轻重的作用，能够引发和维持机体免疫的防御过程。溶菌酶还起到了诱导其它免疫防御因子的合成与分泌，并协同其它免疫因子一起进行免疫的作用，这对于以先天性免疫防御为主的无脊椎动物是极其重要的一部分。 本研究为首次在蛤仔（Ruditapes philippinarum）体内发现并确定噬菌体型溶菌酶；在现有研究中，这也是迄今为止首次于真核生物中发现噬菌体型溶菌酶。实验以我国重要海水养殖贝类蛤仔为研究对象，开展了蛤仔噬菌体型溶菌酶基因(RpLysBp)的克隆和体外重组表达研究，并以四种病原物刺激蛤仔，揭示了其对蛤仔噬菌体型溶菌酶基因表达的影响，初步探索了噬菌体型溶菌酶对于几种常见细菌的抑制作用。实验结果如下： 第一，利用EST蛤仔...
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 我国贝类养殖现状和存在问题
1.2 贝类的机体免疫防御体系
1.3 溶菌酶的分类与生物学功能
1.4 水产动物溶菌酶的研究进展
1.5 研究目的及意义
第二章 蛤仔(Ruditapes philippinarum)噬菌体型溶菌酶基因序列的克隆及序列分析
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 蛤仔总 RNA 的提取
2.2.2 蛤仔噬菌体型溶菌酶基因 cDNA 序列全长获得
2.2.3 蛤仔噬菌体型溶菌酶 cDNA 序列的生物信息学分析
2.3 实验结果
2.3.1 RNA 质量检测
2.3.2 蛤仔 RpLysBp 基因特异性片段的扩增结果
2.3.3 蛤仔 RpLysBp 基因全长及序列分析
2.3.4 蛤仔 RpLysBp 基因的生物信息学分析结果
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 蛤仔(Ruditapes philippinarum)噬菌体型溶菌酶蛋白的原核表达
3.1 实验材料
3.1.1 实验动物、载体、菌株及工具酶
3.1.2 实验试剂及其配制
3.1.3 主要实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1 蛤仔 RpLysBp 基因总 RNA 的提取
3.2.2 第一条 cDNA 链的获得
3.2.3 引物设计及蛤仔 RpLysBp 基因目的片段的扩增
3.2.4 重组质粒 pMD19-T-ORF 的构建及转化(DH5α)
3.2.5 重组质粒 pET-30a-ORF 的构建及转化(BL21)
3.2.6 融合蛋白的诱导表达
3.2.7 菌体的超声波破碎
3.2.8 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
3.2.9 重组蛋白的纯化及浓度测定
3.3 实验结果
3.3.1 ORF 目的片段扩增结果
3.3.2 重组质粒 pMD-19T-ORF 的构建及转化结果
3.3.3 重组质粒 pET-30a-ORF 的构建及鉴定
3.3.4 重组蛋白的纯化及浓度测定
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 蛤仔（Ruditapes philippinarum）噬菌体型溶菌酶荧光定量 PCR 分析
4.1 实验材料
4.1.1 实验动物
4.1.2 主要实验试剂及药品
4.1.3 主要实验仪器
4.2 实验方法
4.2.1 RNA 提取及反转录
4.2.2 不同组织和免疫促进剂刺激后表达变化检测方法
4.2.3 cDNA 第一条链的合成
4.2.4 引物设计
4.2.5 荧光实时定量 PCR 条件的优化
4.2.6 数据处理方法
4.3 实验结果
4.3.1 总 RNA 提取结果
4.3.2 标准曲线的建立
4.3.3 蛤仔 RpLysPh 基因组织特异性表达结果
4.3.4 蛤仔 RpLysPh 在免疫促进剂刺激后的表达规律研究
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 蛤仔（Ruditapes philippinarum）噬菌体型溶菌酶基因多态性（SNP）初步分析
5.1 实验材料
5.1.1 实验动物
5.1.2 实验试剂
5.1.3 实验仪器
5.2 实验方法
5.2.1 蛤仔总 DNA 的提取
5.2.2 引物设计
5.2.3 PCR 扩增和电泳检测
5.2.4 产物纯化和测序
5.3 实验结果
5.4 讨论
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
致谢
本文编号：3939143
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 我国贝类养殖现状和存在问题
1.2 贝类的机体免疫防御体系
1.3 溶菌酶的分类与生物学功能
1.4 水产动物溶菌酶的研究进展
1.5 研究目的及意义
第二章 蛤仔(Ruditapes philippinarum)噬菌体型溶菌酶基因序列的克隆及序列分析
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 蛤仔总 RNA 的提取
2.2.2 蛤仔噬菌体型溶菌酶基因 cDNA 序列全长获得
2.2.3 蛤仔噬菌体型溶菌酶 cDNA 序列的生物信息学分析
2.3 实验结果
2.3.1 RNA 质量检测
2.3.2 蛤仔 RpLysBp 基因特异性片段的扩增结果
2.3.3 蛤仔 RpLysBp 基因全长及序列分析
2.3.4 蛤仔 RpLysBp 基因的生物信息学分析结果
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 蛤仔(Ruditapes philippinarum)噬菌体型溶菌酶蛋白的原核表达
3.1 实验材料
3.1.1 实验动物、载体、菌株及工具酶
3.1.2 实验试剂及其配制
3.1.3 主要实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1 蛤仔 RpLysBp 基因总 RNA 的提取
3.2.2 第一条 cDNA 链的获得
3.2.3 引物设计及蛤仔 RpLysBp 基因目的片段的扩增
3.2.4 重组质粒 pMD19-T-ORF 的构建及转化(DH5α)
3.2.5 重组质粒 pET-30a-ORF 的构建及转化(BL21)
3.2.6 融合蛋白的诱导表达
3.2.7 菌体的超声波破碎
3.2.8 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
3.2.9 重组蛋白的纯化及浓度测定
3.3 实验结果
3.3.1 ORF 目的片段扩增结果
3.3.2 重组质粒 pMD-19T-ORF 的构建及转化结果
3.3.3 重组质粒 pET-30a-ORF 的构建及鉴定
3.3.4 重组蛋白的纯化及浓度测定
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 蛤仔（Ruditapes philippinarum）噬菌体型溶菌酶荧光定量 PCR 分析
4.1 实验材料
4.1.1 实验动物
4.1.2 主要实验试剂及药品
4.1.3 主要实验仪器
4.2 实验方法
4.2.1 RNA 提取及反转录
4.2.2 不同组织和免疫促进剂刺激后表达变化检测方法
4.2.3 cDNA 第一条链的合成
4.2.4 引物设计
4.2.5 荧光实时定量 PCR 条件的优化
4.2.6 数据处理方法
4.3 实验结果
4.3.1 总 RNA 提取结果
4.3.2 标准曲线的建立
4.3.3 蛤仔 RpLysPh 基因组织特异性表达结果
4.3.4 蛤仔 RpLysPh 在免疫促进剂刺激后的表达规律研究
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 蛤仔（Ruditapes philippinarum）噬菌体型溶菌酶基因多态性（SNP）初步分析
5.1 实验材料
5.1.1 实验动物
5.1.2 实验试剂
5.1.3 实验仪器
5.2 实验方法
5.2.1 蛤仔总 DNA 的提取
5.2.2 引物设计
5.2.3 PCR 扩增和电泳检测
5.2.4 产物纯化和测序
5.3 实验结果
5.4 讨论
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
致谢
本文编号：3939143
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