柑橘黄龙病菌亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus）外膜蛋白基因亚细胞定位及表达分析

发布时间：2022-12-07 03:42

　　柑橘黄龙病（CitrusHuanglongbing,HLB）是全球范围内柑橘产业上威胁最大的病害之一,其病原为韧皮部限制性难培养革兰氏阴性菌。外膜蛋白在许多革兰氏阴性菌的致病过程中起重要作用。本课题在我们实验室前期研究的基础上,对具有激发子功能的MotB外膜蛋白基因进行进一步的研究,明确该基因在本氏烟和大肠杆菌中的亚细胞定位及表达特性,取得的主要研究成果如下:1.MotB外膜蛋白基因及其缺失跨膜结构域△tMotB基因在本氏烟（Nicotiana benthamian）中亚细胞定位:采用Gateway技术分别将目的基因（MotB,△tMotB）构建至入门载体pDONRrM/Zeo及植物表达载体pMW390中,采用农杆菌浸润注射接种本氏烟的叶片背面,于接种后48-72 h激光共聚焦观察荧光,结果发现MotB外膜蛋白基因及其缺失跨膜结构域△tMotB基因均在本氏烟的细胞核和胞质处有荧光信号。2.MotB及△tMotB基因引起的本氏烟中10个HR标志基因的表达情况:采用荧光定量 PCR 分析结果表明,SIPK、WIPK、BAK1、RbohB、TOBPAL、ACRE31 基因均基本表现相同趋势,... 

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
缩略词表(Abbreviation)
第一章 文献综述
    1.1 柑橘黄龙病发生与危害
    1.2 HLB病菌
        1.2.1 分类地位及遗传多样性研究
        1.2.2 基因组结构特点及致病机理
    1.3 外膜蛋白研究进展
        1.3.1 OMPs的结构和功能
        1.3.2 肽聚糖相关脂蛋白
    1.4 亚细胞定位
    1.5 植物抗病反应的信号通路
        1.5.1 植物的先天性免疫系统
        1.5.2 免疫反应信号通路
    1.6 研究目的及意义
第二章 CaLas外膜蛋白基因MotB及△tMotB在本氏烟中的亚细胞定位及表达分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 试验材料
        2.1.2 主要供试菌株和质粒
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 目的基因引物设计及扩增
        2.1.5 DNA片段的回收与纯化
        2.1.6 Gateway技术BP反应及LR反应
        2.1.7 质粒的小量提取
        2.1.8 根癌农杆菌GV3101感受态的制备
        2.1.9 热击转化农杆菌GV3101菌株及阳性鉴定
        2.1.10 根癌农杆菌诱导接种本氏烟及瞬时表达
        2.1.11 样品采集
        2.1.12 植物总RNA的提取
        2.1.13 DNA消化
        2.1.14 反转录合成cDNA
        2.1.15 qRT-PCR的扩增
    2.2 结果与分析
        2.2.1 入门载体的构建
        2.2.2 表达载体的构建及目的基因序列分析
        2.2.3 重组载体转化农杆菌阳性鉴定
        2.2.4 MotB及△tMotB基因引起的本氏烟表型
        2.2.5 MotB及△tMotB基因在本氏烟中的亚细胞定位
        2.2.6 MotB与△ tMotB基因引起的防卫相关基因表达分析
    2.3 小结与讨论
第三章 CaLas外膜蛋白基因原核表达及多克隆抗体的制备
    3.1 材料与方法
        3.1.1 主要供试菌株、质粒
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 目的基因引物设计及PCR扩增
        3.1.4 MotB基因蛋白结构预测
        3.1.5 目的片段TA克隆
        3.1.6 E.coli感受态细胞的制备
        3.1.7 热击转化大肠杆菌及阳性转化子的鉴定
        3.1.8 原核表达载体的构建
        3.1.9 目的基因的原核诱导表达
        3.1.10 SDS-PAGE检测
        3.1.11 诱导表达蛋白可溶性分析
        3.1.12 Western blot分析
        3.1.13 目标蛋白的纯化
        3.1.14 多克隆抗体的制备
    3.2 结果与分析
        3.2.1 MotB基因蛋白结构预测
        3.2.2 MotB基因原核表达载体的构建
        3.2.3 MotB基因原核表达载体的诱导表达及条件筛选
        3.2.4 MotB基因原核表达产物的Western blot分析
        3.2.5 重组蛋白的纯化及多克隆抗体效价
    3.3 小结与讨论
第四章 CaLas外膜蛋白在E.coli中定位及泌出性分析
    4.1 材料与方法
        4.1.1 主要试剂、载体及仪器
        4.1.2 引物设计
        4.1.3 基因的扩增
        4.1.4 目的基因和目的载体的处理
        4.1.5 构建含有GFP的重组载体
        4.1.6 目的基因MotB及△tMotB在E.coli中诱导表达
        4.1.7 目的基因蛋白MotB在大肠杆菌中的泌出性分析
        4.1.8 目的基因蛋白MotB及△tMotB在大肠杆菌中的定位
    4.3 结果与分析
        4.3.1 MotB及△tMotB基因原核定位载体的构建
        4.3.2 MotB-1GFP及△tMotB-1GFP重组载体在E.coli中诱导表达
        4.3.3 MotB蛋白在E.coli中泌出性分析
        4.3.4 MotB及△tMotB蛋白在大肠杆菌中定位
    4.4 小结与讨论
第五章 结论与展望
参考文献
附录1: pMD 18-T载体信息
附录2: pET-22b(+)载体图谱及多克隆位点信息
附录3: pET-28a(+)与pET-28b(+)载体图谱及多克隆位点信息
附录4: pET His6 GFP TEV LIC cloning vector (1GFP)载体图谱及信息
附录5: 主要试剂及溶液的配置
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]柑桔黄龙病及其控防对策[J]. 何源委,伍兴甲,何懿平.  湖南农业科学. 2015(01)
[2]蛋白质亚细胞定位的生物信息学研究[J]. 张松,黄波,夏学峰,孙之荣.  生物化学与生物物理进展. 2007(06)
[3]信号肽及其在蛋白质表达中的应用[J]. 韦雪芳,王冬梅,刘思,周鹏.  生物技术通报. 2006(06)
[4]柑桔黄龙病对青霉素和四环素的反应[J]. 赵学源,邱柱石,苏维芳,蒋元晖.  中国柑桔. 1981(04)



本文编号：3712169