降解亚硝酸盐的嗜盐古菌菌株筛选与酶功能研究

发布时间：2020-04-20 07:40

【摘要】：高盐腌制食品中产生的亚硝酸盐具有潜在的致毒、致癌和致畸性。降解亚硝酸盐最常用和最有效的方法是生物法。为了消除腌制食品中亚硝酸盐的危害,本研究选择分布于天然高盐环境的嗜盐古菌为研究对象,筛选降解亚硝酸盐的菌株,进而开展嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶的异源表达与功能研究,希望为嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶在腌制食品加工中的应用提供依据。对我国不同地区的32个高盐环境样品进行高通量测序分析,旨在阐明我国主要盐环境嗜盐古菌的分布格局。结果显示,沿海与内陆、东北与西北盐环境的古菌群落构成差异较大。绝大部分沿海地区的样品是以嗜盐古菌为优势类群,且丰度高、嗜盐古菌群落组成差异大。选择嗜盐古菌为优势类群的新疆六团盐碱地(LT)、山西运城盐池(YCN)、海南莺歌海盐场(YGH)、福建漳浦盐田(ZP)、连云港台南盐田(TNN)等环境样品进行可培养研究,获得的88株嗜盐古菌中Halomicrobium与Haloarcula属的菌株降解亚硝酸盐的能力最强。选择降解率为100%的菌株YCN54和ZP60进行全基因组测序,分别注释出编码亚硝酸盐还原酶的基因nirK_(Hrs)与nirK_(Hmc)。nirK_(Hrs)编码区全长1071 bp,编码356个氨基酸残基;nirK_(Hmc)全长1095 bp,编码364个氨基酸残基。经结构域、信号肽及高级结构预测,表明NirK_(Hrs)与NirK_(Hmc)是含有Cu-nitrite-reductase超家族结构域与信号肽的铜型亚硝酸盐还原酶,且是同三聚体蛋白。通过嗜盐古菌异源表达体系分别表达了NirK_(Hrs)与NirK_(Hmc),经Ni~(2+)柱亲和层析获得了有活性的重组亚硝酸盐还原酶,选择活性更高的重组亚硝酸盐还原酶NirK_(Hrs)进行酶学性质表征。再经过Superdex 200凝胶过滤层析,NirK_(Hrs)的SDS-PAGE结果表明蛋白的表观分子量约为42与48 kDa,且质谱鉴定结果表明所得蛋白即目的蛋白。经全波长扫描可知,NirK_(Hrs)是蓝色的铜型亚硝酸盐还原酶。该酶的最适反应温度为55?C,最适pH为7.0,最适NaCl浓度为4.5 M,且在30、50、70?C下具有良好的热稳定性。对甘油、DMSO、DMF、异丙醇、吐温20、吐温80、10%SDS等有机试剂具有良好的耐受性。食品添加剂——连二亚硫酸钠(Na_2S_2O_4)可以作为有效的电子供体用于亚硝酸盐还原酶的应用中。本研究获得的重组亚硝酸盐还原酶NirK_(Hrs)与已报道嗜盐古菌亚硝酸盐还原酶在性质上具有较大差异,且其最显著的耐盐特性为在高盐腌制食品加工中的应用提供依据。
【图文】：

地理分布图,地理分布,采样点,情况

17图 2.1 采样点的地理分布情况Fig. 2.1 Geographical distribution of sampling points2.3.2 高通量测序文库评价（1）稀释性曲线根据古菌高通量测序文库的稀释性曲线（图2.2），当随机抽取的序列达到3500条时，虽然仍有新的OTU被发现，但是曲线整体趋于平缓，说明更深的测序几乎不会产生更多的OTU，因此该文库的测序结果能够基本代表样品古菌群落的组成，可以用于后续的生物信息学分析。

曲线,古菌,文库,高通量

2.3.2 高通量测序文库评价（1）稀释性曲线根据古菌高通量测序文库的稀释性曲线（图2.2），当随机抽取的序列达到3500条时，虽然仍有新的OTU被发现，但是曲线整体趋于平缓，说明更深的测序几乎不会产生更多的OTU，，因此该文库的测序结果能够基本代表样品古菌群落的组成，可以用于后续的生物信息学分析。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.3

【参考文献】