MORN4和NR4A2影响A549细胞线粒体自噬的分子机制研究

发布时间：2020-04-23 17:19

【摘要】：对于受损的细胞器以及一些细胞胞内不需要的物质,细胞可通过自噬进行消除,进而为细胞自身代谢和某些细胞器的更新提供物质基础,因此,自噬对细胞维持稳态具有重要作用。细胞自噬包括非选择性自噬和选择性自噬。其中线粒体自噬(mitophagy)是选择性自噬,受损的线粒体通过自噬途径被清除,在线粒体质量控制中线粒体自噬起重要作用。鞘氨醇磷酸胆碱(Sphingosylphosphorylcholine,SPC)是天然存在于血液中,由鞘磷脂在脱酰基酶的作用下产生的具有生物活性鞘脂类。研究发现SPC能调节癌细胞的增殖、迁移、凋亡。我们实验室前期研究发现SPC能促进A549细胞自噬,并且影响ROS和线粒体膜电位。线粒体膜电位降低,同时会伴随线粒体自噬的增加。目前,SPC在线粒体自噬中的作用及机制还未搞清。对基因芯片结果的分析,我们发现并且证明SPC能够增加MORN4和NR4A2的表达。MORN4(the membrane occupation and recognition nexus repeats 4 times)是包含4个MORN motif的蛋白。MORN motif广泛存在于动物、植物和原生生物的蛋白中,数量从2-17不等。实验室前期研究发现,在H9c2心肌细胞中,SPC使MORN4的表达上调,并且研究发现SPC通过JNK/MORN4/MFN2促进的自噬抑制其凋亡。MORN4在A549细胞中是否参与自噬并且是否能够调节线粒体自噬尚不清楚。NR4A2(Nuclear receptor subfamily 4,group A,member 2)也叫 Nurr1,与NR4A1,NR4A3组成NR4A孤核受体家族。研究发现,在肿瘤、肥胖,特别是神经类疾病的发生中,NR4A2起到一定作用。如:在肺癌细胞中NR4A2与p53结合后,抑制凋亡。实验室前期也证明ROS/NF-κB/NR4A2通路参与双氧水经自噬诱导小鼠心脏sca+细胞凋亡的过程,但是尚未搞清NR4A2在SPC通路中的作用。本研究中,我们发现A549经SPC处理后,LC3-Ⅱ表达增加,mtDNA含量降低,Tim23表达降低,线粒体膜电位降低、线粒体合成激活基因PGC1B的表达增加等指标变化,这些结果证明了SPC能够促进A549线粒体自噬。进一步发现SPC能够上调其表达。利用MORN4慢病毒干扰质粒降低其表达后,线粒体自噬进一步增加,说明MORN4可能对SPC的功能起到负反馈作用。由于降低MORN4的表达后,线粒体融合蛋白mfn2表达降低,因此推测MORN4可能通过调节mfn2影响线粒体自噬。通过对以上结果的分析,我们认为:A549细胞中SPC可诱导线粒体自噬,而线粒体自噬导致线粒体数量减少,同时发现了MORN4和PGC1B的表达上调。MORN4上调后,引起下游mfn2的表达,mfn2通过加强线粒体融合,使部分线粒体免于自噬以维持线粒体的基础数量,表观上产生自噬降低的状况。同时,经SPC处理或MORN4干扰抑制引起线粒体自噬增加后,诱导了包括PGC1B在内的新线粒体合成途径,以增加线粒体数量,维持细胞内线粒体数量的动态平衡。在对NR4A2的研究中发现,SPC也能增加NR4A2表达,与基因芯片检测的结果一致;慢病毒转染干扰质粒LV3-NR4A2,敲减NR4A2后,增加A549细胞线粒体自噬功能,与MORN4的研究结果类似,这一过程也可能是通过mfn2实现的;NR4A2过表达后A549细胞自噬增加,线粒体自噬降低。过表达NR4A2后加入SPC处理使LC3-Ⅱ水平增加,mtDNA含量和Tim23表达增加,PGC1B含量降低等,说明NR4A2参与到SPC促进A549细胞线粒体自噬中。
【图文】：

图２．ＳＰＣ上调ＭＯＲＮ４表达，ＣＣＣＰ能够降低ＭＯＲＮ４表达

自噬,细胞线粒体,光检测

图４．干扰ＭＯＲＮ４增加Ａ５４９细胞线粒体自噬。降低ＭＯＲＮ４表达后，１０ｐＭ逡逑ＳＰＣ／２0ｎＭ邋ＣＣＣＰ邋处理邋６ｈ邋“Ａ）ＱＰＣＲ邋检测邋ｍｔＤＮＡ邋水平。（Ｂ）ＱＰＣＲ邋检测邋ＰＧＣ１Ｂ逡逑水平。（Ｃ）邋ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋检测邋ＭＯＲＮ４邋敲低后邋Ｔｉｍ２３邋表达，ＬＣ３－ＩＩ邋表达。（Ｄ，Ｅ）逡逑ＬＣ３－ＩＩ／ａｃｔｉｎ，邋Ｔｉｍ２３／ａｃｔｉｎ邋统计结果。（Ｆ，，Ｇ）免疫焚光检测邋Ｔｉｍ２３邋表达。＊ｐ＜逡逑０．０５；＊＊ｐ＜０＿０１＿邋ｎ邋＝邋３。逡逑２２逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q25

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