枯草芽孢杆菌中dlt操纵子对多粘菌素E抗性的影响机制研究

发布时间：2020-05-01 17:54

【摘要】：多粘菌素作为抗多重耐药革兰氏阴性菌的最后一道防线,现在已经被广泛应用于革兰氏阴性菌的治疗。近年来,越来越多的研究表明,阳离子抗菌肽多粘菌素同样可以作用于革兰氏阳性菌。而随着多粘菌素的应用,革兰氏阳性菌中已经发现了应对这种阳离子抗菌肽的抗性机制。dlt操纵子可通过对革兰氏阳性菌细胞壁的丙酰化,对细胞表面的正电荷进行修饰,从而增加对多粘菌素E的抗性。本文着眼于多粘菌素E和枯草芽孢杆菌的相互作用,对dlt操纵子在多粘菌素E的抗性机制中的作用展开研究。本文选取枯草芽孢杆菌WB800来源的dlt操纵子基因和大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pWBUC01,设计XhoⅠ和MluⅠ为双酶切位点,经酶切连接在大肠杆菌BW25113中构建dlt操纵子重组质粒pWOP。随后,通过Spizizen化学转化法,将重组质粒pWOP转入枯草芽孢杆菌SCK6中,成功获得dlt操纵子过表达的枯草芽孢杆菌SCK6-2。通过比较多粘菌素E对枯草芽孢杆菌SCK6/pWBUC01(枯草芽孢杆菌SCK6-1)和枯草芽孢杆菌SCK6-2的MIC值,发现SCK6-2比SCK6-1菌株更耐受多粘菌素E,说明dlt操纵子过表达有助于提高枯草芽孢杆菌对多粘菌素E的耐受性。通过比较SCK6-1和SCK6-2菌株在多粘菌素E处理下的生长曲线及CFU,发现dlt操纵子过表达能提高多粘菌素E处理下枯草芽孢杆菌的存活率。为了进一步研究dlt操纵子过表达提高枯草芽孢杆菌对多粘菌素E耐受性的原因,我们比较了多粘菌素E处理下菌株培养上清液的OD_(260nm)和OD_(280nm)下吸光度及NPN荧光值变化,发现dlt操纵子可减弱多粘菌素E对枯草芽孢杆菌通透性的影响。随后,使用阳离子蛋白质细胞色素c表征dlt操纵子过表达后细胞表面净负电荷的变化,发现dlt操纵子的过表达会降低枯草芽孢杆菌与细胞色素c的结合,表明dlt操纵子的过表达可增加枯草芽孢杆菌表面的正电荷,降低净负电荷量,从而减弱带正电荷的多粘菌素E对细胞的静电结合作用。由于多粘菌素E生产菌多粘类芽孢杆菌不含dlt操纵子,dlt操纵子在多粘类芽孢杆菌中表达有望提高其抗性,从而提高多粘菌素E的产量。为此,本实验考察了枯草芽孢杆菌源dlt操纵子在多粘类芽孢杆菌中的表达及其影响。首先优化了多粘类芽孢杆菌ATCC842和多粘类芽孢杆菌C12的电转化条件,建立了最优的电转化体系。接着,构建了含dltA基因的重组质粒pWDA。然后,在电转化最优体系下,将pWDA和pWOP分别电转化多粘类芽孢杆菌ATCC842,发现pWDA能被成功转化,但效率比较低;而pWOP不能被成功转化至菌株ATCC842。可能的原因是多粘类芽孢杆菌电转化效率本身比较低。另外,dlt操纵子比dltA大的多,这进一步增加了pWOP电转化难度。后续实验中,需要进一步提高电转化效率,另外也可以建立更有效的多粘类芽孢杆菌转化方法。由此,进一步研究dlt操纵子表达为提高多粘类芽孢杆菌对多粘菌素E抗性的可能性及其机制,为今后增加多粘菌素E的发酵产量提供新的思路。
【图文】：

图 1-1 多粘菌素 B 和粘菌素的化学结构[6]Figure 1-1. Chemical structure of polymyxin B and colistin[6]注：多粘菌素的不同颜色区域如下：黄色，脂肪酰基链; 绿色，线性三肽片段; 红色，七肽的极性残基; 蓝色，七肽环内的疏水基序。多粘菌素B和多粘菌素E 的6 号位置分别是D-Phe和 D-Leu。脂肪酸：6-甲基辛酸或异辛酸或辛酸或庚酸; Thr：苏氨酸; Phe：苯丙氨酸; Leu：亮氨酸; Dab：α，γ-二氨基丁酸。临床上多粘菌素主要应用于革兰氏阴性菌，被广泛接受的作用机制主要是对细胞膜的破坏和对呼吸链的胁迫作用，前者是一种主要机制，而后者常被称为是一种“辅助机制”[10]。在引起细胞膜破坏的机制中，多粘菌素通过静电相互作用结合至革兰氏阴性细菌表面，后通过“自我摄取”机制对细胞膜进行穿孔，对细胞膜的完整性进行破坏从而杀死细菌[2, 3, 8, 11]。在此机制中，多粘菌素中一个重要的结构特征是存在多个带正电荷的 L-α-γ-二氨基丁酸（Dab）侧链与细菌表面带负电荷的脂质 A 上的磷酸基团相互作用。此外，已有研究证明缺乏脂肪酰基尾的 N末端 Thr2-Dab3二肽基序的多粘菌素 B 九肽（PMBN）无法行使抗菌机制。因此，，

图 1-2 氧化应激诱导多粘菌素产生羟自由基的死亡机制[30, 35]Figure1-2. Death mechanism of polymyxin induced by oxidative stress to phydroxyl radicals[30, 35].菌素通过细胞膜后，刺激三羧酸循环以加速 NADH 的产生，并且通过电2-的产生。O2-攻击铁-硫簇以释放 Fe2+。O2-通过 SOD 转化为 H2O2。在芬2-和 Fe2+转化为 OH 和 Fe3+。细胞内 OH、O2-和 H2O2对 DNA，脂质和蛋白损害最终导致细胞死亡。细胞呼吸的副产物，超氧化物，过氧化氢和羟基自由基可统称为 R细胞毒性。但因细胞内不存在可以解毒羟基自由基的酶，所以羟基的氧化毒害作用比超氧化物和过氧化氢的作用尖锐[27]。这种过胞的氧化杀伤机制可以增加我们对多粘菌素作用于革兰氏阳性菌一步认识。菌素对 Exportal 的破坏Alberto Vega 等人研究发现，在亚致死浓度下，多粘菌素 B 可以优
【学位授予单位】：浙江工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q93

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本文编号：2646907