MEF2C调控巨噬细胞M1极化及Th1细胞反应的研究

发布时间：2020-05-03 19:23

【摘要】：巨噬细胞(macrophage)在固有免疫中发挥重要作用,受到病原菌刺激后产生多种与炎症相关细胞因子和趋化因子,调控炎症的进程。同时,巨噬细胞具有强大的吞噬能力,抗原提呈能力,能够直接吞噬、杀伤入侵病原菌,从而在调控固有免疫和适应性免疫的稳态中发挥重要作用。目前的研究证实,巨噬细胞是一类异质性的免疫细胞,具有较强的可塑性,能对环境信号作出有效反应,并根据刺激信号改变表型和生理功能,对病原体引起的炎症发生和消退至关重要。一般认为巨噬细胞主要分为两类,一类是经典活化的巨噬细胞(classically activated macrophage),也称之为M1,是一群促炎性的巨噬细胞;另一种是选择性活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophage),也称之为M2,是一群抑炎性的巨噬细胞。巨噬细胞不同的细胞表型,在应对不同的微环境时能够发挥不同的生理功能,以调控整个免疫系统的稳态。MEF2C是MEF2家族中重要的一员。作为特异性的转录因子,MEF2C在神经系统发育、心脏形态发生、肌细胞分化中起到重要的作用。近年来研究证实MEF2C在炎症和T/B淋巴细胞的发育等免疫相关生理病理状态中也起到重要作用。本研究中,我们首先用siRNA干扰巨噬细胞MEF2C基因表达,LPS刺激后发现IL-12、IL-23、iNOS等M1细胞的分子标志(marker)表达显著下调,而IL-10、Arg-1等M2细胞的分子标志(marker)表达升高,过表达实验得出相一致的结果。同时,我们诱导培养M1和M2巨噬细胞,RT-PCR和WB检测发现MEF2C在M1细胞中高表达,而在M2细胞中低表达,以上结果提示MEF2C可能在巨噬细胞极化中起重要作用。利用新构建的巨噬细胞MEF2C特异性敲除的小鼠,通过流式细胞术检测发现巨噬细胞MEF2C缺陷,其M1 marker CD11c表达明显下调,而M2 marker CD206表达明显升高。在LPS体内诱导的炎症模型和李斯特菌感染模型中,RT-PCR等检测发现MEF2C缺陷的巨噬细胞表型与体外结果一致。在李斯特菌感染模型中,我们发现巨噬细胞MEF2C缺陷的小鼠在脾和肝等脏器内李斯特菌的载量比对照组明显增多,且巨噬细胞MEF2C缺陷的小鼠肝脏损伤也更严重;感染致死剂量李斯特菌后,MEF2C缺陷组死亡率高于对照组。同时,体外实验发现巨噬细胞MEF2C缺陷杀伤李斯特菌的能力也明显减弱。体外T细胞分化实验表明,巨噬细胞MEF2C缺陷LPS刺激收取的上清,诱导Naive CD4T细胞分化为Th1细胞能力明显减弱。分子机制上,我们通过双荧光素酶报告基因实验和ChIP实验证实,MEF2C可以直接结合到IL-12和IL-10的启动子上调控其基因的转录。综上所述,我们实验证实,MEF2C通过调控IL-12/IL-10基因的表达,从而调控巨噬细胞的极化和Th1细胞反应,进而调控机体的固有免疫和适应性免疫应答。
【图文】：

图２．１．１邋ｐＣＭＶ－Ｔａｇ－２Ｂ质粒骨架图谱逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１．１邋ｐＣＭＶ－Ｔａｇ－２Ｂ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｍａｐ逡逑酶报告基因系统包含２个荧光素酶报告基因质粒，分ｐＭＩＲ－ＲＥＰＯＲＴＴＭ邋Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ邋和邋ｐＲＬ－ＴＫ－Ｒｅｎｉｌｌａ邋对、ＩＬ－１２ｐ４０亚基和ＩＬ－１０基因的ｐｒｏｍｏｔｏｒ序列均插入３－ＲＥＰＯＲＴＴＭ邋Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ的多克隆位点，，从而构建－１０的报告基因质粒。其余报告基因质粒是本实验室告基因质粒购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，其详细质粒构架图ＳＶ４０ｐｏ＾Ａ，逦，捕＿逡逑．Ｐｍｏｌ邋（４７６）逡逑如撕，逦丨逦．丨（？？咐逡逑：．邋一逡逑？－Ｓａｄ＿逡逑Ｓｐ？Ｊ邋（Ｓ２Ｓ）逡逑

图２．１．３邋ｐＲＬ－ＴＫ－Ｒｅｎｉｌｌａ质粒骨架图谱逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１．３邋ｐＲＬ－ＴＫ－Ｒｅｎｉｌｌａ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｍａｐ逡逑杆菌感受态购买自ＴＡＫＡＲＡ公司；单核李斯特菌剂盒（离心柱式）购买自Ａｘｙｇｅｎ公司；去内毒素买自Ｏｍｅｇａ公司。逡逑回收试剂盒和ＰＣＲ产物纯化试剂盒均购买自ＡｘｙＲ聚合酶ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ购买自ＴＡＫＡＲＡ公司。逡逑酶邋ＢａｍＨ邋Ｉ、ＥｃｏＲ邋１、ＥｃｏＲ邋Ｖ、Ｘｈｏ邋Ｉ、Ｎａｅｌ邋和邋Ｈｉ合酶（２＞＜ＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ邋（Ｄｙｅ））购买自康为世
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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