发酵乳杆菌L-乳酸脱氢酶的筛选鉴定及其在L-丹参素合成中的应用

发布时间：2020-05-05 15:47

【摘要】：L-丹参素(L-DSS)是一种极具生理活性和药用价值的水溶性酚酸类化合物,以抗血栓、抗氧化、抗菌消炎、降血脂、改善微循环等显著药理作用,在预防和治疗心脑血管疾病方面有着广阔的开发前景。此外,它还是合成多种手性物质和生物活性物质的重要中间体。自然界中不存在L-丹参素,从植物丹参中分离得到的是它的对映异构体D-丹参素。对D-和L-丹参素的药理活性和强度进行比较,发现它们具有相同的药理活性,且L-丹参素的药学强度更加突出。近年来,陆续出现了化学合成L-丹参素的报道,但由于其存在污染严重、操作繁琐、成本高、产物光学纯度差、合成效率低等缺点,很大程度上受到了工业化应用的限制。因此,有必要探索出一条绿色安全、操作简单、效率高、成本低廉的合成单一手性L-丹参素的生物途径。研究表明,乳酸脱氢酶能立体选择性还原α-酮酸生成α-羟基羧酸,这为L-丹参素的生物合成提供了参考依据。本研究将L-乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因进行共表达,全细胞催化底物3,4-二羟基苯丙酮酸、葡萄糖生产L-丹参素。主要研究成果如下:(1)从实验室保藏的20株乳酸菌中筛选了一株具有较高3,4-二羟基苯丙酮酸还原活性的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum JN248)。通过对同菌属的Lactobacillus fermentum F-6的全基因组进行分析,从L.fermentum JN248中克隆到了5个L-乳酸脱氢酶基因(lf-l-ldh0845、lf-l-ldh1566、lf-l-ldh1732、lf-l-ldh0611和lf-l-ldh0372,蛋白分子量为32~34 kDa),连接到质粒pETDuet-1上,并导入大肠杆菌中进行诱导表达。对纯化前后的酶液进行SDS-PAGE分析和酶活力检测,发现这5个酶在理论蛋白分子量处都出现明显条带,且LF-L-LDH0845的酶活力最强。(2)对LF-L-LDH0845的酶学性质进行研究,结果发现:LF-L-LDH0845在pH6.0时活性最高且最稳定;最适温度为25℃,在10-25℃时稳定性较好;具有广泛的底物作用范围,最适底物为丙酮酸,其次为苯丙酮酸;对3,4-二羟基苯丙酮酸的K_m、K_(cat)、K_(cat)/K_m分别为11.3709 mM、0.2931 S~(-1)、0.0258 mM~(-1)·S~(-1)。(3)利用来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶与LF-L-LDH0845一起构建了大肠杆菌BL21(DE3)/pETDuet-1-ldh-gdh双酶共表达菌株,以实现辅酶的再生。对诱导条件进行了优化,最佳诱导条件组合为:菌体浓度OD_(600)=0.5,诱导剂浓度0.4 mmol·L~(-1),诱导温度20℃,诱导时长25 h。(4)对全细胞转化条件进行了优化,最佳转化条件为:转化温度25℃,转化体系pH=6.5,菌体湿重为20 g·L~(-1),3,4-二羟基苯丙酮酸浓度为70 mmol·L~(-1)。最终,L-丹参素的产量达到15.91 g·L~(-1)。
【图文】：

丹参素,对映异构体,化学结构式

究人员就对其化学组分进行了分析，发现它主要由两类化合物家族烯奎宁化合物（如丹参酮、隐丹参酮、异噻嗪酮等）和亲水性的多、丹酚酸 B、原儿茶醛等）[1]。丹参作为东方医学上的传统中药，距最先记载于秦汉时期《神农本草经》，后于明朝时期在《本草纲目》正式收录在《中国药典》中，传承至现在[2]。（Danshensu，简称 DSS）是从丹参中发现的水溶性酚类羧酸化合物基苯乳酸（3,4-dihydroxyphenyllactic acid）。它的化学结构中含有儿茶稳定，，导致丹参素的化学性质极不稳定，在碱性和高温条件下易聚通常将其制成钠盐（丹参素钠），贮藏于阴凉干燥处。丹参素存在两 D-DSS 与其对映异构体 L-DSS，结构式如图 1-1 所示。我们与西北合作，进行了丹参素的相关研究，发现 L-丹参素和 D-丹参素具有类-丹参素，L-丹参素的药理活性更加显著，这一结论也正好在前人[3, 验证。除此之外，L-丹参素还能作为合成多种多酚酸类化合物的前 E. Bogucki 等人[5]利用 L-丹参素、咖啡酸等前体物质，经一系列化学香酸。

示意图,丹参素,重组大肠杆菌,示意图

江南大学硕士学位论文学性质研究，为酶法生产 L-丹参素奠定了理论和技术基础。L基苯丙酮酸转化为 L-丹参素的反应需要辅酶 NADH 或 NADPH ADPH 比较昂贵，在酶催化反应过程中仅靠外源添加会增加生产枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶和 L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中进丙酮酸和葡萄糖为底物，全细胞生产 L-丹参素，实现辅酶 NAD利用，此外，细胞自身产生的辅酶也能被全细胞反应体系充分菌全细胞催化体系的诱导条件和全细胞催化条件进行优化，成高光学纯度的 L-丹参素的生产工艺路线，为 L-丹参素的工业化及参考价值。用重组大肠杆菌全细胞生产 L-丹参素的示意图如图 1-2 所示：
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.3

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