植物乳杆菌中β-1,6-半乳糖苷酶的重组表达及酶学性质研究
发布时间：2021-11-13 23:08
半乳糖苷酶是一种水解半乳糖苷键的糖苷酶,在食品、药品和造纸等工业中应用广泛,可降解半乳聚糖和半乳寡糖等。同时,也可以用于多糖结构修饰和解析中。阿拉伯半乳聚糖在植物组织中含量丰富,功能多样,是一种重要的半乳聚糖。阿拉伯半乳聚糖的构效关系研究一直受限于其结构分析,所以寻找专一性好的半乳糖苷酶对研究其构效关系具有重要意义。植物乳杆菌作为一种肠道益生菌能够代谢半乳聚糖,基因组学研究表明其含有多种β-半乳糖苷酶基因。本论文对其β-半乳糖苷酶进行重组表达和酶学性质研究,以期发现和制备能够用于分析阿拉伯半乳聚糖的酶。具体研究成果如下:1.以植物乳杆菌基因组为模板,成功克隆出两个β-半乳糖苷酶基因lpgal42和lpgal2,分别属于糖苷水解酶家族42（GH42）和家族2（GH2）。将目的基因与pET-28a（+）载体连接后转移到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,获得重组菌株lpgal42-pET-28a（+）-BL21（DE3）和lpgal2-pET-28a（+）-BL21（DE3）。重组菌株在25℃ 0.5mM IPTG条件下诱导16 h,可实现重组蛋白LpGal42和LpGal2的可溶性表...
【文章来源】：东北师范大学吉林省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
糖苷水解酶保持型和反转型催化机制[35]
樱?钪招纬砂肴樘呛推咸烟恰Ｈ绻??成的半乳糖-酶中间体随后将半乳糖传递给其他合适的亲核试剂，那么就会合成半乳寡糖（Galacto-OligosaccharidesGOS）。在合成寡糖的过程中，初始反应时溶液中乳糖浓度比较高，所以亲核试剂一般是乳糖，但随着反应的进行，产物中的葡萄糖、半乳糖或者半乳寡糖也可以作为亲核试剂参与反应，从而形成聚合度和糖苷键不同的GOS。除此之外，还可以利用β-半乳糖苷酶的水解活性来制备GOS，如一些外切-β-1,3-半乳聚糖酶可以绕过侧链去降解AG-II的主链，降解过程中可释放出侧链的β-1,6-半乳寡糖。图1-2水解反应及糖基转移反应示意图[60]利用β-半乳糖苷酶的转糖基活性或水解活性制备的GOS是一种不易被消化的益生元，能够促进乳酸杆菌和双歧杆菌等有益菌的生长[30]，进而减少病原菌的数量，提高免疫力[61]。研究显示，GOS对人的健康多有益处，例如，它能够降低人粪便的pH，预防龋病，降低血清胆固醇水平等。因此在食品产业中，GOS常被用作为婴儿奶、谷物类食物和软饮料等的添加成分以及低卡路里的甜味剂。目前，商业化的GOS大多是通过酶促反应合成的，具有良好的选择性[62]。3．用于乳清加工乳品工业在生产奶酪时会产生大量的副产物——乳清，乳清中的主要成分为乳糖、矿物质和蛋白质，尽管有一部分乳清用于生产浓缩蛋白，但全世界产生的大量乳清被当做废物排放入水中，造成水污染和资源的浪费[63]，在β-半乳糖苷酶的作用下，他们可以转化成有应用价值的乙醇[64]，还可以转化成细胞培养的有效底物[65]。乳清通过超滤可以获得高功能的乳清蛋白，通过进一步的水解可以产生药物中间体[66]。β-半乳糖苷酶还能够水解乳清中的乳糖，将乳清乳糖转化为许多合适的产品，如用于面包厂和糖果厂的甜糖浆。4．促进水果软化和成熟
作为报告基因方面也有相应的应用。大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可将X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）水解成5-溴-4-氯-3-羟基吲哚和半乳糖，而生成的5-溴-4-氯-3-羟基吲哚会自发形成二聚体，该二聚体氧化后会形成深蓝色的物质。因此，β-半乳糖苷酶基因可作为载体组成的一部分，当外源基因插入半乳糖苷酶基因后，就无法合成有活性的β-半乳糖苷酶，也就无法水解X-Gal。根据菌落的颜色便可以判断外源基因是否插入成功。β-半乳糖苷酶基因还可以作为报告基因来研究启动子的效能，研究表达系统中增强序列的功能等[73]。图1-3β-半乳糖苷酶水解X-Gal示意图[74]1.2植物乳杆菌概述乳酸菌是一类能利用碳水化合物发酵产生乳酸的细菌的统称，其种类繁多，包括至少18个属，共200多种。部分研究表明，某些乳酸菌菌株，特别是乳酸杆菌属的菌株，会利于人类和动物的健康[75]。乳杆菌属中包含了大量的物种，表现出较高的多样性[76]，其中，植物乳杆菌在不同的生态位中均有分布，在乳制品，肉类，蔬菜和植物的发酵过程中扮演重要角色。此外，植物乳杆菌还是人类肠道中的益生菌，与人类的健康息息相关[77,78]。1.2.1植物乳杆菌生物学特性植物乳杆菌是一种不产气，非孢子型的乳酸菌，属于革兰氏阳性细菌[79]，是厌氧或兼性厌氧的化能异养型细菌，其生长需要从外界获取糖、氨基酸、维生素等物质来满足自身生长和代谢的需要。植物乳杆菌的最适生长温度为30-35oC，最适生长pH为6.5左
【参考文献】：
期刊论文
[1]枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子的研究进展[J]. 熊海涛,韦宇拓. 广西科学. 2018(03)
[2]植物乳杆菌的生理功能及应用[J]. 王水泉,包艳,董喜梅,苏芳,姚国强,张和平. 中国农业科技导报. 2010(04)
[3]β-半乳糖苷酶研究进展[J]. 张莉,李庆章,田雷. 东北农业大学学报. 2009(07)
[4]嗜酸乳酸杆菌ATCC4356菌株异源二聚体β-半乳糖苷酶的克隆表达[J]. 潘渠,李晋川,丛延广,刘丽娜,朱军民,胡福泉. 微生物学报. 2008(10)
[5]徐长卿中阿拉伯半乳聚糖CPB64的化学结构[J]. 王顺春,金丽伟,方积年. 药学学报. 1999(10)
[6]兴安落叶松阿拉伯糖基半乳聚糖化学结构的研究[J]. 蒋杏芬,李民栋. 纤维素科学与技术. 1996(01)
博士论文
[1]耐热β-半乳糖苷酶BgaB分子改造以及突变体性质研究[D]. 董艺凝.江南大学 2011
硕士论文
[1]纤维素酶枯草芽孢杆菌表达系统的建立及初步应用[D]. 赵情.山东农业大学 2019
[2]芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质和功能基团研究[D]. 李蕊伽.西南大学 2017
本文编号：3493895
【文章来源】：东北师范大学吉林省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
糖苷水解酶保持型和反转型催化机制[35]
樱?钪招纬砂肴樘呛推咸烟恰Ｈ绻??成的半乳糖-酶中间体随后将半乳糖传递给其他合适的亲核试剂，那么就会合成半乳寡糖（Galacto-OligosaccharidesGOS）。在合成寡糖的过程中，初始反应时溶液中乳糖浓度比较高，所以亲核试剂一般是乳糖，但随着反应的进行，产物中的葡萄糖、半乳糖或者半乳寡糖也可以作为亲核试剂参与反应，从而形成聚合度和糖苷键不同的GOS。除此之外，还可以利用β-半乳糖苷酶的水解活性来制备GOS，如一些外切-β-1,3-半乳聚糖酶可以绕过侧链去降解AG-II的主链，降解过程中可释放出侧链的β-1,6-半乳寡糖。图1-2水解反应及糖基转移反应示意图[60]利用β-半乳糖苷酶的转糖基活性或水解活性制备的GOS是一种不易被消化的益生元，能够促进乳酸杆菌和双歧杆菌等有益菌的生长[30]，进而减少病原菌的数量，提高免疫力[61]。研究显示，GOS对人的健康多有益处，例如，它能够降低人粪便的pH，预防龋病，降低血清胆固醇水平等。因此在食品产业中，GOS常被用作为婴儿奶、谷物类食物和软饮料等的添加成分以及低卡路里的甜味剂。目前，商业化的GOS大多是通过酶促反应合成的，具有良好的选择性[62]。3．用于乳清加工乳品工业在生产奶酪时会产生大量的副产物——乳清，乳清中的主要成分为乳糖、矿物质和蛋白质，尽管有一部分乳清用于生产浓缩蛋白，但全世界产生的大量乳清被当做废物排放入水中，造成水污染和资源的浪费[63]，在β-半乳糖苷酶的作用下，他们可以转化成有应用价值的乙醇[64]，还可以转化成细胞培养的有效底物[65]。乳清通过超滤可以获得高功能的乳清蛋白，通过进一步的水解可以产生药物中间体[66]。β-半乳糖苷酶还能够水解乳清中的乳糖，将乳清乳糖转化为许多合适的产品，如用于面包厂和糖果厂的甜糖浆。4．促进水果软化和成熟
作为报告基因方面也有相应的应用。大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可将X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）水解成5-溴-4-氯-3-羟基吲哚和半乳糖，而生成的5-溴-4-氯-3-羟基吲哚会自发形成二聚体，该二聚体氧化后会形成深蓝色的物质。因此，β-半乳糖苷酶基因可作为载体组成的一部分，当外源基因插入半乳糖苷酶基因后，就无法合成有活性的β-半乳糖苷酶，也就无法水解X-Gal。根据菌落的颜色便可以判断外源基因是否插入成功。β-半乳糖苷酶基因还可以作为报告基因来研究启动子的效能，研究表达系统中增强序列的功能等[73]。图1-3β-半乳糖苷酶水解X-Gal示意图[74]1.2植物乳杆菌概述乳酸菌是一类能利用碳水化合物发酵产生乳酸的细菌的统称，其种类繁多，包括至少18个属，共200多种。部分研究表明，某些乳酸菌菌株，特别是乳酸杆菌属的菌株，会利于人类和动物的健康[75]。乳杆菌属中包含了大量的物种，表现出较高的多样性[76]，其中，植物乳杆菌在不同的生态位中均有分布，在乳制品，肉类，蔬菜和植物的发酵过程中扮演重要角色。此外，植物乳杆菌还是人类肠道中的益生菌，与人类的健康息息相关[77,78]。1.2.1植物乳杆菌生物学特性植物乳杆菌是一种不产气，非孢子型的乳酸菌，属于革兰氏阳性细菌[79]，是厌氧或兼性厌氧的化能异养型细菌，其生长需要从外界获取糖、氨基酸、维生素等物质来满足自身生长和代谢的需要。植物乳杆菌的最适生长温度为30-35oC，最适生长pH为6.5左
【参考文献】：
期刊论文
[1]枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子的研究进展[J]. 熊海涛,韦宇拓. 广西科学. 2018(03)
[2]植物乳杆菌的生理功能及应用[J]. 王水泉,包艳,董喜梅,苏芳,姚国强,张和平. 中国农业科技导报. 2010(04)
[3]β-半乳糖苷酶研究进展[J]. 张莉,李庆章,田雷. 东北农业大学学报. 2009(07)
[4]嗜酸乳酸杆菌ATCC4356菌株异源二聚体β-半乳糖苷酶的克隆表达[J]. 潘渠,李晋川,丛延广,刘丽娜,朱军民,胡福泉. 微生物学报. 2008(10)
[5]徐长卿中阿拉伯半乳聚糖CPB64的化学结构[J]. 王顺春,金丽伟,方积年. 药学学报. 1999(10)
[6]兴安落叶松阿拉伯糖基半乳聚糖化学结构的研究[J]. 蒋杏芬,李民栋. 纤维素科学与技术. 1996(01)
博士论文
[1]耐热β-半乳糖苷酶BgaB分子改造以及突变体性质研究[D]. 董艺凝.江南大学 2011
硕士论文
[1]纤维素酶枯草芽孢杆菌表达系统的建立及初步应用[D]. 赵情.山东农业大学 2019
[2]芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质和功能基团研究[D]. 李蕊伽.西南大学 2017
本文编号：3493895
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