基于分子伴侣策略提高NADPH依赖型醇脱氢酶的异源可溶性表达

发布时间：2021-12-17 07:16

　　目的:生物催化的氧化还原反应广泛应用于手性化合物的制备,其中很多反应涉及辅酶NADPH的原位再生。以异丙醇为辅助底物,利用醇脱氢酶再生NADPH,具有比酶活高、副产物丙酮易于分离等优势,受到越来越多的关注。选择极具应用潜力的来源于Clostridium beijerinckii的醇脱氢酶CbADH作为研究对象,针对其在大肠杆菌中的可溶性表达差、酶活低的瓶颈问题开展研究。方法:首先通过引入诱导型质粒p Gro7表达分子伴侣GroES-GroEL,将pET-28a(+)质粒表达CbADH的可溶性提高了3.57倍,酶活达到出发菌株的4.83倍。其次,考察了另外三种不同的分子伴侣表达策略:pET-28a(+)单质粒共表达、基因组强化表达GroES-GroEL和组成型改造pGro7/GroES-GroEL和pET-28a(+)/CbADH双质粒共表达。结果:组成型改造pGro7和pET-28a(+)双质粒共表达策略的效果最优,其CbADH的可溶性表达提高了8.07倍,酶活达到了21.79U/mg DCW,是出发菌株的9.43倍。结论:为CbADH的工业应用奠定了良好的基础,也为外源蛋白的可溶性表...

【文章来源】： 中国生物工程杂志. 2020,40(08)北大核心CSCD

【文章页数】：9 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株和质粒
        1.1.2 主要试剂
        1.1.3 主要仪器
    1.2 方法
        1.2.1 Cb ADH表达菌株构建
        1.2.2 分子伴侣与CbADH共表达菌株的构建与培养
        1.2.3 pET单质粒共表达菌株的构建
        1.2.4 基因组强化表达Gro ES-GroEL菌株的构建
        1.2.5 组成型p Gro7和pET双质粒共表达菌株的构建
        1.2.6 摇瓶发酵产酶
        1.2.7 菌体浓度测定
        1.2.8 细胞干重测定
        1.2.9 醇脱氢酶酶活测定
        1.2.1 0 SDS-PAGE蛋白电泳
        1.2.1 1 蛋白质灰度分析
2 结果与分析
    2.1 Cb ADH在E.coli BL21(DE3)中的重组表达
    2.2 不同的分子伴侣蛋白对Cb ADH可溶性表达的影响
    2.3 p ET单质粒共表达策略提高Cb ADH的可溶性表达
    2.4 基因组强化表达GroES-GroEL策略提高Cb ADH的可溶性表达
    2.5 组成型p Gro7和p ET双质粒共表达策略提高Cb ADH的可溶性表达
    2.6 分子伴侣GroES-GroEL的表达量与Cb ADH酶活的关系
3 结论



本文编号：3539636