集胞藻PCC6803中α-酮戊二酸脱羧酶的原核表达分析

发布时间：2022-01-15 08:14

　　【目的】α-酮戊二酸脱羧酶（α-ketoglutaric acid decarboxylase,α-KGD）是蓝细菌三羧酸循环途径中的一个关键酶。试验旨在优化集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白的原核表达方法,并对不同表达方法获得的重组sll1981蛋白进行活性测定。【方法】利用分子生物学技术构建含有sll1981基因的多种表达载体,通过SDSPAGE分析这些表达载体在大肠杆菌表达系统中的表达和可溶性情况,利用Ni-NTA亲和层析分离纯化重组sll1981蛋白,然后通过酶偶联法测定重组sll1981蛋白的催化活性。【结果】含有sll1981基因的不同表达载体在大肠杆菌表达系统中的表达良好,然而重组sll1981蛋白的可溶性和催化活性差异较大。【结论】当pET28bsll1981质粒与pTf16分子伴侣质粒在大肠杆菌中共表达时重组sll1981蛋白的可溶性和催化活性均为最佳。酶动力学测试表明集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白具有α-酮戊二酸脱羧酶功能。为进一步研究α-酮戊二酸脱羧酶的结构功能关系及催化机制提供重要基础。 

【文章来源】：江西农业大学学报. 2020,42(03)北大核心CSCD

【文章页数】：11 页

【部分图文】：

集胞藻PCC6803的sll1981基因PCR扩增和菌落PCR鉴定

在大肠杆菌中自诱导表达外源基因获得重组蛋白的方法简便易操作，因此本研究也探索了自诱导表达方式对pET28b-sll1981重组质粒在大肠杆菌中表达重组sll1981蛋白的影响。结果表明，在16℃时自诱导16 h没有诱导表达sll1981蛋白，自诱导20 h后该菌株表达了非常少量的sll1981蛋白。当诱导时间达24 h后sll1981蛋白被大量表达。因此，采用自诱导培养基也能有效表达重组sll1981蛋白，然而此方法表达的sll1981蛋白可溶性并没有显著提高（图5A）。此前研究表明过表达分子伴侣蛋白可以促进目的蛋白的折叠，从而提高重组蛋白的可溶性。本研究采用pET28b-sll1981重组质粒与分子伴侣质粒pTf16共转化大肠杆菌表达sll1981蛋白的方式，其结果如图5B所示。分子伴侣质粒pTf16表达的触发因子tig蛋白大小为56 ku，比目的蛋白sll1981小，与电泳结果中显示的tig蛋白处于sll1981蛋白下方一致，下图接近55 ku的蛋白分子即为触发因子tig蛋白。由图5B可知，与分子伴侣质粒pTf16共表达可以显著提高sll1981蛋白的可溶性。同时笔者也构建了pET32a-sll1981和pColdTF-sll1981重组质粒，其分别含有可能提高重组蛋白可溶性的Trx和触发因子TF标签。研究结果表明sll1981蛋白连接Trx标签后其可溶性没有显著提高，然而sll1981蛋白连接TF标签后其可溶性显著提高，表达的sll1981蛋白基本都在上清中（图5C）。图3 不同温度下重组sll1981蛋白诱导表达

不同温度下重组sll1981蛋白诱导表达

【参考文献】：
期刊论文
[1]基因工程菌生产抗菌肽的研究进展[J]. 黄佳明,姜宁,张爱忠.  微生物学通报. 2019(03)
[2]集胞藻PCC6803中sll1981基因的克隆与表达研究[J]. 龙昊知,李至敏,王小琴,吴晓玉,张宝,王飞,李志敏.  江西农业大学学报. 2015(06)
[3]蛋白质功能研究:历史、现状和将来[J]. 马静,葛熙,昌增益.  生命科学. 2007(03)



本文编号：3590254