根癌农杆菌中RNase D同源蛋白的结构与功能研究
发布时间：2022-02-20 17:49
RNase D（RND）在细胞中负责多种RNA分子3’端的成熟,它广泛存在于细菌和真核生物中。目前对来自大肠杆菌中的RNase D蛋白（EcRND）研究最为详细。它有三个保守的结构域:N端参与催化的DEDD结构域和C端参与底物结合的两个HRDC结构域。然而在众多的RNaseD同源蛋白中,C端的HRDC结构域并不完全保守,有的同源蛋白仅保留了一个HRDC结构域,部分同源蛋白甚至仅有DEDD结构域。同时,在有的细菌中同时存在不止一个RNase D同源蛋白。目前对于这些缺少HRDC结构域的RNase D蛋白还缺乏研究,尤其是它们如何在缺少底物结合结构域的情况下发挥酶活还并没有合理的解释。本课题以根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中的RNase D同源蛋白为目标,使用blastp在根癌农杆菌中鉴定出了两个在序列组成上有显著差异的两个RNase D 同源蛋白:Atu1 151（AtRND）和Atu4108（AtNrnC）。AtRND含有典型RND的全部3个结构域,它和大肠杆菌中的...
【文章来源】：山东大学山东省211工程院校985工程院校教育部直属院校
【文章页数】：132 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 前言
1.1 核酸的降解机制
1.2 核酸酶的分类
1.3 RNase D的功能与结构研究
1.4 NanoRNases的功能与结构研究
1.4.1 Orn
1.4.2 NrnA and NrnB
1.4.3 NrnC
1.5 本文的研究目的和内容
第二章 At_RND和At_NrnC蛋白的表达与纯化
2.1 At_RND和At_NrnC蛋白序列的分析
2.1.1 At_RND蛋白序列的分析
2.1.2 At_NrnC蛋白序列的分析
2.1.3 At_RND和At_NrnC蛋白纯化片段的选取
2.2 实验材料
2.2.1 菌株和载体
2.2.2 试剂和工具酶
2.2.3 主要仪器
2.2.4 主要缓冲液的配制
2.3 实验方法
2.3.1 分子克隆
2.3.2 蛋白质的分离纯化
2.4 实验结果
2.4.1 野生型At_NrnC蛋白的表达与纯化
2.4.2 At_RND和Ec_RND蛋白的表达与纯化
2.4.3 At_NrnC突变体蛋白的表达与纯化
2.5 本章小结
第三章 AT_RND和At_NrnC晶体的筛选和优化
3.1 实验材料和方法
3.1.1 材料
3.1.2 试剂
3.1.3 晶体的生长
3.1.4 At_RND和At_NrnC晶体的初筛与优化
3.2 实验结果
3.2.1 At_RND晶体初筛和优化
3.2.2 At_NrnC晶体的初筛和优化
3.2.3 At_NrnC-Mn~(2+)晶体的优化
3.3 本章小结
第四章 衍射数据的收集与结构的解析
4.1 X-ray衍射晶体学的基本原理
4.1.1 X射线衍射
4.1.2 蛋白质晶体的衍射
4.1.3 衍射数据的收集与处理
4.1.4 搭模与结构修正
4.2 实验方法与结果
4.2.1 衍射数据的收集与处理
4.2.2 分子置换法的实施过程和结果
4.2.3 搭模与结构修正的实施过程和结果
4.3 本章小结
第五章 At_RND和At_NrnC的结构分析
5.1 实验材料
5.2 实验原理和方法
5.2.1 分子筛层析色谱(Size-exclusion chromatography,SEC)
5.2.2 分析超离(Analytical ultracentrifugation,AUC)
5.2.3 分子动力学(Molecular dynamics,MD)
5.3 At_RND的结构及分析
5.3.1 At_RND的结构
5.3.2 At_RND的活性中心
5.3.3 At_RND表面电势的分析
5.3.4 At_RND的聚集态分析
5.4 At_NrnC的结构及分析
5.4.1 At_NrnC的结构
5.4.2 At_NrnC的活性中心
5.5 At NrnC聚集态的研究
5.5.1 At_NrnC晶体堆积的分析
5.5.2 At_NrnC的SEC分析结果
5.5.3 At_NrnC的AUC分析结果
5.5.4 At_NrnC的分子动力学模拟
5.6 本章小结
第六章 At_RND和At_NrnC的功能与结构研究
6.1 实验材料
6.2 实验方法
6.2.1 dsRNA与dsDNA的制备
6.2.2 At_RND和At_NrnC酶活的检测
6.2.3 分子孔道的计算与dsDNA的docking
6.3 实验结果及讨论
6.3.1 At_RND和At_NrnC对RNA的活性
6.3.2 At_RND和At_NrnC对DNA的活性
6.3.3 At_NrnC聚集态与酶活关系的研究
6.3.4 At_NrnC降解dsDNA的模型
6.3.5 At_NrnC催化机理的分析
6.3.6 At_RND与At_NrnC底物类型与结构的联系
6.4 本章总结
全文总结
附录
附录一 晶体优化的条件
附录二 GROMACS的运行参数
参考文献
致谢
攻读博士学位期间发表的论文
学位论文评阅及答辩情况表
本文编号：3635536
【文章来源】：山东大学山东省211工程院校985工程院校教育部直属院校
【文章页数】：132 页
【学位级别】：博士
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摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 前言
1.1 核酸的降解机制
1.2 核酸酶的分类
1.3 RNase D的功能与结构研究
1.4 NanoRNases的功能与结构研究
1.4.1 Orn
1.4.2 NrnA and NrnB
1.4.3 NrnC
1.5 本文的研究目的和内容
第二章 At_RND和At_NrnC蛋白的表达与纯化
2.1 At_RND和At_NrnC蛋白序列的分析
2.1.1 At_RND蛋白序列的分析
2.1.2 At_NrnC蛋白序列的分析
2.1.3 At_RND和At_NrnC蛋白纯化片段的选取
2.2 实验材料
2.2.1 菌株和载体
2.2.2 试剂和工具酶
2.2.3 主要仪器
2.2.4 主要缓冲液的配制
2.3 实验方法
2.3.1 分子克隆
2.3.2 蛋白质的分离纯化
2.4 实验结果
2.4.1 野生型At_NrnC蛋白的表达与纯化
2.4.2 At_RND和Ec_RND蛋白的表达与纯化
2.4.3 At_NrnC突变体蛋白的表达与纯化
2.5 本章小结
第三章 AT_RND和At_NrnC晶体的筛选和优化
3.1 实验材料和方法
3.1.1 材料
3.1.2 试剂
3.1.3 晶体的生长
3.1.4 At_RND和At_NrnC晶体的初筛与优化
3.2 实验结果
3.2.1 At_RND晶体初筛和优化
3.2.2 At_NrnC晶体的初筛和优化
3.2.3 At_NrnC-Mn~(2+)晶体的优化
3.3 本章小结
第四章 衍射数据的收集与结构的解析
4.1 X-ray衍射晶体学的基本原理
4.1.1 X射线衍射
4.1.2 蛋白质晶体的衍射
4.1.3 衍射数据的收集与处理
4.1.4 搭模与结构修正
4.2 实验方法与结果
4.2.1 衍射数据的收集与处理
4.2.2 分子置换法的实施过程和结果
4.2.3 搭模与结构修正的实施过程和结果
4.3 本章小结
第五章 At_RND和At_NrnC的结构分析
5.1 实验材料
5.2 实验原理和方法
5.2.1 分子筛层析色谱(Size-exclusion chromatography,SEC)
5.2.2 分析超离(Analytical ultracentrifugation,AUC)
5.2.3 分子动力学(Molecular dynamics,MD)
5.3 At_RND的结构及分析
5.3.1 At_RND的结构
5.3.2 At_RND的活性中心
5.3.3 At_RND表面电势的分析
5.3.4 At_RND的聚集态分析
5.4 At_NrnC的结构及分析
5.4.1 At_NrnC的结构
5.4.2 At_NrnC的活性中心
5.5 At NrnC聚集态的研究
5.5.1 At_NrnC晶体堆积的分析
5.5.2 At_NrnC的SEC分析结果
5.5.3 At_NrnC的AUC分析结果
5.5.4 At_NrnC的分子动力学模拟
5.6 本章小结
第六章 At_RND和At_NrnC的功能与结构研究
6.1 实验材料
6.2 实验方法
6.2.1 dsRNA与dsDNA的制备
6.2.2 At_RND和At_NrnC酶活的检测
6.2.3 分子孔道的计算与dsDNA的docking
6.3 实验结果及讨论
6.3.1 At_RND和At_NrnC对RNA的活性
6.3.2 At_RND和At_NrnC对DNA的活性
6.3.3 At_NrnC聚集态与酶活关系的研究
6.3.4 At_NrnC降解dsDNA的模型
6.3.5 At_NrnC催化机理的分析
6.3.6 At_RND与At_NrnC底物类型与结构的联系
6.4 本章总结
全文总结
附录
附录一 晶体优化的条件
附录二 GROMACS的运行参数
参考文献
致谢
攻读博士学位期间发表的论文
学位论文评阅及答辩情况表
本文编号：3635536
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