多粘类芽孢杆菌中果胶裂解酶的发掘及功能研究

发布时间：2023-01-26 07:48

　　果胶裂解酶（pectate lyase,EC 4.2.2.2）催化果胶聚合物中α-1,4-糖苷键的断裂,在纺织工业和果汁工业等领域均具有重要的应用前景。本课题从多粘类芽孢杆菌KF-1发酵液上清中,通过阳离子交换柱SP Sepharose fast-flow column分离出果胶裂解酶活性组分,并通过LC-MS/MS质谱进行鉴定,得到四种果胶裂解酶,它们分别属于不同的果胶裂解酶家族（PL）1,3,9和10。由于家族10的果胶裂解酶以往研究较少,在本论文中,选取属于该家族的果胶裂解酶进行研究,并将该果胶裂解酶命名为PpPel10a。从Paenibacillus polymyxa KF-1基因组中扩增出pppel10a基因,并将其克隆到pET-28a（+）载体上,并转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,在宿主菌中进行重组表达。使用Ni-NTA agarose column亲和层析柱对含有His6-tag的重组酶进行纯化。重组酶PpPel10a的预测分子量为45.2 kDa,预测等电点为pH 9.41。以聚半乳糖醛酸（PGA）为底物,确定了PpPel10a反应的最佳条件。PpPel10... 

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【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 果胶
        1.1.1 果胶的结构
        1.1.2 果胶的应用
    1.2 果胶酶
        1.2.1 果胶酶的概述
        1.2.2 果胶酶的来源
        1.2.3 果胶酶的应用
    1.3 果胶裂解酶
        1.3.1 果胶裂解酶的概述
        1.3.2 果胶裂解酶的来源
        1.3.3 果胶裂解酶的纯化
        1.3.4 果胶裂解酶的应用
    1.4 蛋白组学
        1.4.1 蛋白组学的概述
        1.4.2 蛋白组学的应用
    1.5 固定化酶
        1.5.1 固定化酶的概述
        1.5.2 壳聚糖固定化酶
        1.5.3 果胶酶固定化研究进展
    1.6 研究目标及研究内容
        1.6.1 研究目标
        1.6.2 研究内容
第二章 多粘类芽孢杆菌KF-1中果胶裂解酶的发掘及PL10果胶裂解酶的异源表达
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌种及培养基
        2.1.2 试剂
        2.1.3 实验仪器
    2.2 LC-MS/MS发掘P.polymyxa KF-1 中的果胶裂解酶
        2.2.1 P.polymyxa KF-1 的培养
        2.2.2 P.polymyxa KF-1 中果胶裂解酶的分离纯化
        2.2.3 从P.polymyxa KF-1 分离的果胶裂解酶的LC-MS/MS分析
        2.2.4 PL10果胶裂解酶序列分析
    2.3 PL10果胶裂解酶的克隆、表达与纯化
        2.3.1 PL10果胶裂解酶的克隆
        2.3.2 目的蛋白的诱导与表达
        2.3.3 目的蛋白的纯化
        2.3.4 重组目的蛋白的检测
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 P.polymyxa KF-1 的培养
        2.4.2 P.polymyxa中果胶裂解酶的分离纯化
        2.4.3 果胶裂解酶级分LC-MS/MS分析
        2.4.5 PL10果胶裂解酶序列分析
        2.4.6 PL10果胶裂解酶的克隆
        2.4.7 目的蛋白的表达及纯化
    2.5 本章小结
第三章 PL10 果胶裂解酶PpPel10a的功能研究
    3.1 实验材料和仪器
        3.1.1 重组酶和底物
        3.1.2 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 重组PpPel10a的性质研究
        3.2.2 PpPel10a降解橘皮果胶产物分析
        3.2.3 PpPel10a的应用研究
    3.3 实验结果与讨论
        3.3.1 重组PpPel10a的性质研究
        3.3.2 PpPel10a降解橘皮果胶的产物分析
        3.3.3 PpPel10a的应用研究
    3.4 本章小结
第四章 重组PpPel10a的固定化
    4.1 实验材料和仪器
        4.1.1 酶液和底物
        4.1.2 试剂
        4.1.3 实验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 壳聚糖微球载体的制备
        4.2.2 壳聚糖微球载体固定化酶
        4.2.3 固定化酶活力的测定
        4.2.4 固定化条件的单因素优化
        4.2.5 响应面分析
        4.2.6 固定化酶与游离酶的酶学性质对比
        4.2.7 储存稳定性的比较
        4.2.8 重复使用次数测定
        4.2.9 固定化PpPel10a微球的SEM观察
        4.2.10 固定化酶的FTIR表征
    4.3 实验结果与讨论
        4.3.1 固定化单因素的优化
        4.3.2 响应面分析
        4.3.3 最优条件验证实验
        4.3.4 固定化酶和游离酶的性质比较
        4.3.5 储存稳定性的比较
        4.3.6 重复使用次数测定
        4.3.7 固定化PpPel10a微球的SEM观察
        4.3.8 固定化酶的FTIR表征
    4.4 本章小结
第五章 结论和展望
参考文献
致谢
附录


【参考文献】：
期刊论文
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[3]壳聚糖固定糖化酶及其酶学性质研究[J]. 张文勇,葛振龙,赵润柱.  保鲜与加工. 2018(06)
[4]壳聚糖固定化海藻糖合酶[J]. 黄珍,王慧,黄芳,李欣,王志,代俊,陈雄.  食品工业科技. 2018(19)
[5]壳聚糖固定化胃蛋白酶的工艺优化及稳定性研究[J]. 黄程,蔡林林,童晓倩,史青青,罗红宇.  中国食品学报. 2017(01)
[6]高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定乳粉中的低聚果糖[J]. 耿丽娟,黄峻榕,冯峰,蒋萍萍,储晓刚,张峰,凌云.  色谱. 2014(12)
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[8]果胶研究与应用进展[J]. 谢明勇,李精,聂少平.  中国食品学报. 2013(08)
[9]响应面法优化壳聚糖固定化果胶酶对玛咖汁澄清的效果[J]. 徐涓,张弘,孙彦琳,周梅村,郑华,张雯雯,李坤.  食品科学. 2013(16)
[10]海藻酸钠固定化果胶酶的研究[J]. 李鸿玉,厉重先,李祖明.  食品科技. 2010(04)

硕士论文
[1]以壳聚糖微球为载体固定化果胶酶处理白水阴离子垃圾的研究[D]. 黎小敏.华南理工大学 2010



本文编号：3732324