Es-BMP2通过调控驱动蛋白KIFC1表达参与中华绒螯蟹精子发生
发布时间：2023-03-19 09:24
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是研究十足目甲壳动物精子发生的模式物种之一。对中华绒螯蟹精子发生动力学和信号通路调控研究,有助于阐明其生殖调控机制。骨形态发生蛋白(BMPs)是转化生长因子β(TGFβ)超家族中一个重要的分支,广泛参与胚胎发育、细胞增殖、细胞分化等生理活动。本研究主要探究TGFβ超家族中BMP2在中华绒螯蟹精子发生过程中发挥的功能及其可能的分子机制。首先从中华绒螯蟹精巢组织中克隆获得编码BMP2同源蛋白的基因,中华绒螯蟹es-bmp2基因CDS长1215bp,共编码404个氨基酸。Es-BMP2包含一段跨膜结构域及TGFβ结构域。与其他物种同源序列比对分析发现,其TGFβ结构域氨基酸序列相对保守。系统进化树分析发现,其与三疣梭子蟹BMP2蛋白聚为一支。为检测Es-BMP2蛋白的表达水平和细胞水平定位情况,本研究通过原核表达Es-BMP2融合蛋白及小鼠腹腔注射抗原,制备了Es-BMP2鼠多克隆抗体。随后利用RT-PCR和Western blot技术探究了Es-BMP2在中华绒螯蟹各组织中的表达模式,并通过免疫荧光实验观察了Es-BMP2在精巢中的分布情况...
【文章页数】：95 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
ABSTRACT
缩略词及术语表
1 前言
1.1 精子发生
1.1.1 哺乳动物的精子发生过程
1.1.2 中华绒螯蟹的精子发生过程
1.2 TGFβ超家族信号转导概述
1.2.1 性腺发育和精子发生中的TGFβ超家族
1.2.2 BMP2信号通路的相关研究进展
1.3 甲壳动物中的TGFβ超家族
1.4 精子发生中的驱动蛋白
1.4.1 精子形成中的细胞骨架结构
1.4.2 Kinesins在细胞分裂和精子形成中的功能
1.4.3 驱动蛋白14家族KIFC1参与细胞分裂和顶体发生
2 材料与方法
2.1 实验动物
2.2 实验试剂
2.2.1 基因克隆及载体构建相关试剂
2.2.2 考马斯亮蓝染色、免疫印迹相关试剂及其配制
2.2.3 抗体制备相关试剂
2.2.4 苏木精-伊红染色相关试剂及其配制
2.2.5 免疫荧光相关试剂及其配制
2.2.6 细胞培养及体外干扰相关试剂
2.3 实验仪器
2.4 分子克隆实验方法
2.4.1 总RNA提取与反转录c DNA
2.4.2 基因片段克隆
2.4.3 Rapid amplification of cDNA end(RACE)
2.4.4 PCR产物验证
2.4.4.1 PCR产物纯化
2.4.4.2 T-载体连接及大肠杆菌转化
2.4.4.3 挑取单克隆菌落及送测
2.4.5 生物信息学分析
2.5 多克隆抗体制备
2.5.1 原核表达菌株的构建
2.5.1.1 原核表达载体引物设计
2.5.1.2 克隆目的片段
2.5.1.3 质粒抽提
2.5.1.4 双酶切反应
2.5.1.5 获得含有重组融合表达载体的菌株
2.5.2 融合蛋白的表达、检测与纯化
2.5.2.1 融合蛋白的诱导表达
2.5.2.2 融合蛋白诱导表达检测(考马斯亮蓝染色)
2.5.2.3 融合蛋白的纯化
2.5.3 抗原免疫注射
2.6 免疫印迹
2.6.1 组织蛋白准备
2.6.2免疫印迹实验
2.7 半定量PCR
2.8 免疫荧光
2.8.1 冰冻切片的准备
2.8.2 组织冰冻切片免疫荧光
2.9 中华绒螯蟹活体干扰
2.9.1 dsRNA表达载体构建
2.9.2 dsRNA的诱导表达
2.9.3 dsRNA的纯化
2.9.4 中华绒螯蟹活体干扰
2.9.5 HE染色形态学观察
2.10精巢原代细胞培养及体外干扰实验
3 实验结果与分析
3.1 中华绒螯蟹ES-BMP2基因全长克隆及特征分析
3.2 ES-BMP2同源蛋白多序列比对及进化树分析
3.3 ES-BMP2基因在中华绒螯蟹中的表达特异性
3.4 ES-BMP2在精子发生过程不同阶段的生殖细胞中的定位
3.5 ES-BMP2参与调节中华绒螯蟹精子形成过程
3.6 BMP2可能通过调节KINESIN-14马达蛋白KIFC1的表达来维持精子形成
3.7 ES-KIFC1是ES-BMP2的信号下游分子
4 结论和展望
4.1 BMP2参与调节中华绒螯蟹精子发生中精核形态的建成
4.2 中华绒螯蟹ES-BMP2的调节ES-KIFC1表达的分子机制
参考文献
附录 I
硕士期间相关研究成果
本文编号：3765000
【文章页数】：95 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
ABSTRACT
缩略词及术语表
1 前言
1.1 精子发生
1.1.1 哺乳动物的精子发生过程
1.1.2 中华绒螯蟹的精子发生过程
1.2 TGFβ超家族信号转导概述
1.2.1 性腺发育和精子发生中的TGFβ超家族
1.2.2 BMP2信号通路的相关研究进展
1.3 甲壳动物中的TGFβ超家族
1.4 精子发生中的驱动蛋白
1.4.1 精子形成中的细胞骨架结构
1.4.2 Kinesins在细胞分裂和精子形成中的功能
1.4.3 驱动蛋白14家族KIFC1参与细胞分裂和顶体发生
2 材料与方法
2.1 实验动物
2.2 实验试剂
2.2.1 基因克隆及载体构建相关试剂
2.2.2 考马斯亮蓝染色、免疫印迹相关试剂及其配制
2.2.3 抗体制备相关试剂
2.2.4 苏木精-伊红染色相关试剂及其配制
2.2.5 免疫荧光相关试剂及其配制
2.2.6 细胞培养及体外干扰相关试剂
2.3 实验仪器
2.4 分子克隆实验方法
2.4.1 总RNA提取与反转录c DNA
2.4.2 基因片段克隆
2.4.3 Rapid amplification of cDNA end(RACE)
2.4.4 PCR产物验证
2.4.4.1 PCR产物纯化
2.4.4.2 T-载体连接及大肠杆菌转化
2.4.4.3 挑取单克隆菌落及送测
2.4.5 生物信息学分析
2.5 多克隆抗体制备
2.5.1 原核表达菌株的构建
2.5.1.1 原核表达载体引物设计
2.5.1.2 克隆目的片段
2.5.1.3 质粒抽提
2.5.1.4 双酶切反应
2.5.1.5 获得含有重组融合表达载体的菌株
2.5.2 融合蛋白的表达、检测与纯化
2.5.2.1 融合蛋白的诱导表达
2.5.2.2 融合蛋白诱导表达检测(考马斯亮蓝染色)
2.5.2.3 融合蛋白的纯化
2.5.3 抗原免疫注射
2.6 免疫印迹
2.6.1 组织蛋白准备
2.6.2免疫印迹实验
2.7 半定量PCR
2.8 免疫荧光
2.8.1 冰冻切片的准备
2.8.2 组织冰冻切片免疫荧光
2.9 中华绒螯蟹活体干扰
2.9.1 dsRNA表达载体构建
2.9.2 dsRNA的诱导表达
2.9.3 dsRNA的纯化
2.9.4 中华绒螯蟹活体干扰
2.9.5 HE染色形态学观察
2.10精巢原代细胞培养及体外干扰实验
3 实验结果与分析
3.1 中华绒螯蟹ES-BMP2基因全长克隆及特征分析
3.2 ES-BMP2同源蛋白多序列比对及进化树分析
3.3 ES-BMP2基因在中华绒螯蟹中的表达特异性
3.4 ES-BMP2在精子发生过程不同阶段的生殖细胞中的定位
3.5 ES-BMP2参与调节中华绒螯蟹精子形成过程
3.6 BMP2可能通过调节KINESIN-14马达蛋白KIFC1的表达来维持精子形成
3.7 ES-KIFC1是ES-BMP2的信号下游分子
4 结论和展望
4.1 BMP2参与调节中华绒螯蟹精子发生中精核形态的建成
4.2 中华绒螯蟹ES-BMP2的调节ES-KIFC1表达的分子机制
参考文献
附录 I
硕士期间相关研究成果
本文编号：3765000
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3765000.html
教材专著
