敲除Ac148-150对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒复制和外源蛋白表达的影响

发布时间：2023-08-18 16:48

　　【目的】同时敲除苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组的Ac148、Ac149、Ac150(Ac148-150)基因,检测敲除Ac148-150基因片段对AcMNPV复制和外源蛋白表达能力的影响,为基因功能鉴定和缩小杆状病毒基因组提供参考。【方法】利用Red/ET同源重组系统和rpsL-AMP反向筛选系统对Ac148-150基因进行敲除,得到敲除型杆状病毒质粒(KOAc148-150杆状病毒质粒),提取AcMNPV KOAc148-150杆状病毒质粒和野生型杆状病毒质粒,将其分别与报告基因表达载体共转染Sf9细胞,成功构建重组杆状病毒(野生型病毒vAcMNPV/GFP和缺失突变病毒vAc△148-150/GFP),测定2种重组杆状病毒的一步生长曲线并比较其差异。将2种重组杆状病毒感染Sf9细胞后,采用荧光显微镜观察GFP荧光细胞分布,用流式细胞仪检测GFP荧光强度,再通过SDS-PAGE和Western blot检测Ac148-150缺失突变体表达的GFP产量。【结果】菌落PCR结果表明,AcMNPV中Ac148-150基因敲除成功。缺失突变病毒vAc△148-150/GFP...

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【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材 料
        1.1.1 菌株、质粒和细胞系
        1.1.2 主要试剂
    1.2 方 法
        1.2.1 AcMNPV KOAc148-150杆状病毒质粒的构建
            (1)含有Ac148-150基因两侧同源臂rpsl-AMP片段的扩增。
            (2)AcMNPV Ac148-150的敲除。
            (3)敲除Ac148-150基因菌落的筛选。
        1.2.2 重组杆状病毒的构建
        1.2.3 重组杆状病毒一步生长曲线的测定
        1.2.4 荧光显微镜分析重组杆状病毒在Sf9细胞中GFP的表达情况
        1.2.5 流式细胞仪分析重组杆状病毒在Sf9细胞中GFP的表达
        1.2.6 SDS-PAGE和Western blot检测重组杆状病毒在Sf9细胞中GFP的表达情况
2 结果与分析
    2.1 AcMNPV-rpsl-AMP片段的扩增
    2.2 敲除Ac148-150基因AcMNPV阳性菌落的鉴定
    2.3 重组杆状病毒的检测
    2.4 重组杆状病毒在Sf9细胞中GFP的表达
        2.4.1 荧光显微镜法分析
        2.4.2 流式细胞仪分析
        2.4.3 SDS-PAGE和Western blot检测
3 讨 论



本文编号：3842571