寨卡病毒NS2A通过伴侣分子介导的自噬降解KPNA2的机制研究
发布时间：2023-12-09 09:56
寨卡病毒(ZIKA Virus,ZIKV)是一种主要通过伊蚊传播的RNA病毒,属于黄病毒科黄病毒属中的成员。该病毒于1947年首次分离于乌干达地区的寨卡森林。ZIKV大多数感染者表现为无症状或仅有轻微症状,孕妇感染ZIKV可以将病毒传播给胎儿,致使新生儿患有先天性严重小头畸形和神经系统缺陷,同时还可以引起早产或流产。成年人感染ZIKV会引起一种罕见的严重自身免疫性疾病-格林-巴利综合征。在第一次有记载的太平洋岛发生人感染ZIKV案例和近期南美ZIKV流行性感染暴发并迅速传播至全球60多个国家之前,该病毒并未受到关注。最近在中美洲和南美洲爆发的疫情引起了公众对ZIKV感染的广泛关注,对ZIKV的研究也有一些新的进展。然而,ZIKV与宿主细胞互作的机制尚未确定,针对ZIKV的疫苗或治疗ZIKV感染的药物尚未研制成功。在本实验室对KPNA6和ZIKV互作机制的研究中发现,ZIKV感染宿主细胞可以引起核转运蛋白KPNA6的表达升高,KPNA6基因敲除可以抑制ZIKV的复制。在应用蛋白质质谱分析未感染和ZIKV感染样品的实验中,筛选出ZIKV感染后降低的多个蛋白,其中,KPNA2在ZIKV感染后...
【文章页数】：136 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
abstract
英文缩写词表
引言
第一篇 文献综述
第1章 寨卡病毒研究进展
1.1 ZIKV分子生物学及病毒学特征
1.1.1 ZIKV病毒学分类
1.1.2 ZIKV形态结构和理化特性
1.1.3 ZIKV基因组结构及功能
1.2 ZIKV生命周期
1.3 ZIKV致病机制
1.3.1 ZIKV感染的趋向性
1.3.2 ZIKV感染导致细胞死亡的机制
1.3.3 宿主细胞限制因子干扰ZIKV病毒复制的机制
1.3.4 ZIKV的免疫逃避机制
1.4 ZIKV的预防与治疗
第2章 核输入蛋白
2.1 核定位信号
2.2 核运输体系
2.2.1 核孔复合物
2.2.2 核胞质转运体
2.2.3 Ran GTPase
2.3 经典核蛋白导入的分子机制
2.4 核输入蛋白KPNA的生物学功能
第3章 伴侣分子介导的自噬
3.1 CMA的发现
3.2 CMA的分子机制
3.2.1 货物分子的选择
3.2.2 HSC70 参与CMA通路
3.2.3 溶酶体受体LAMP2A的功能
3.3 CMA在生理学中的意义
3.4 CMA的临床意义
3.4.1 CMA抵抗衰老的作用
3.4.2 CMA在神经退行性疾病中的意义
3.4.3 CMA在癌症中的意义
第二篇 研究内容
第1章 寨卡病毒对核输入蛋白KPNA2的影响
1.1 材料
1.1.1 细胞、病毒、试剂、抗体
1.1.2 主要仪器
1.2 方法
1.2.1 ZIKV病毒的繁殖
1.2.2 Western Blot检测KPNA2 蛋白水平
1.2.3 RT-q PCR检测KPNA2 m RNA水平
1.2.4 不同细胞系KPNA2蛋白水平的检测
1.2.5 Western Blot检测感染时间和感染复数对KPNA2 的影响
1.2.6 图像处理及统计分析
1.3 结果
1.3.1 ZIKV感染对KPNA2 水平的影响
1.3.2 ZIKV感染时间和感染复数对KPNA2 的影响
1.4 讨论
1.5 小结
第2章 核输入蛋白KPNA2的降解途径
2.1 材料
2.1.1 细胞、病毒、试剂、抗体、载体
2.1.2 主要仪器
2.2 方法
2.2.1 KPNA2蛋白降解部位的确定
2.2.2 细胞活力测定实验检测MG132和NH4CL对细胞活力的影响
2.2.3 RT-q PCR检测MG132和NH4CL对 ZIKV感染的影响
2.2.4 KPNA2蛋白半衰期的检测
2.2.5 免疫共沉淀检测KPNA2泛素化水平
2.2.6 免疫共沉淀检测KPNA2与LAMP2A相互作用
2.2.7 激光共聚焦检测KPNA2与LAMP2A共定位
2.2.8 LAMP2A敲降细胞系的建立
2.2.9 细胞活力测定实验检测LAMP2A敲降细胞的活力
2.2.10 检测LAMP2A敲降细胞内ZIKV感染对KPNA2 水平的影响
2.2.11 图像处理及统计分析
2.3 结果
2.3.1 KPNA2蛋白降解部位的确定
2.3.2 ZIKV对 KPNA2 半衰期的影响
2.3.3 ZIKV感染对KPNA2 泛素化水平的影响
2.3.4 免疫共沉淀对KPNA2与LAMP2A相互作用的检测
2.3.5 激光共聚焦对KPNA2与LAMP2A相互作用的检测
2.3.6 LAMP2A敲降对KPNA2 的影响
2.3.7 LAMP2A敲降对ZIKV病毒导致的KPNA2 降低的影响
2.4 讨论
2.5 小结
第3章 ZIKV非结构蛋白NS2A对 KPNA2 降解作用机制
3.1 材料
3.1.1 细胞、病毒、试剂、抗体、载体
3.1.2 主要仪器
3.2 方法
3.2.1 寨卡病毒蛋白重组质粒的构建
3.2.2 Western Bolt检测寨卡病毒蛋白对KPNA2 蛋白表达水平的影响
3.2.3 不同剂量NS2A对 KPNA2 蛋白表达水平的影响
3.2.4 ZIKV NS2A与 KPNA2 之间相互作用的检测
3.2.5 LAMP2A敲降对ZIKV NS2A和 KPNA2 相互作用的影响
3.2.6 细胞活力测定实验检测NS2A质粒转染对HEK293 细胞的影响
3.2.7 ZIKV NS2A蛋白结构的预测及质粒构建
3.2.8 ZIKV NS2A截短突变体对KPNA2 重组蛋白表达的影响
3.2.9 ZIKV NS2A点突变体的构建
3.2.10 ZIKV NS2A点突变体对KPNA2 重组蛋白表达的影响
3.2.11 免疫共沉淀验证T100A点突变对NS2A与 KPNA2 之间相互作用的影响
3.2.12 T100A点突变对ZIKV病毒复制的影响
3.2.13 图像处理及统计分析
3.3 结果
3.3.1 ZIKV病毒蛋白对KPNA2 表达水平的影响
3.3.2 ZIKV NS2A与 KPNA2 之间的相互作用
3.3.3 LAMP2A敲除对NS2A与 KPNA2 相互作用的影响
3.3.4 ZIKV NS2A截短突变体对KPNA2 重组蛋白表达的影响
3.3.5 ZIKV NS2A点突变体对KPNA2 重组蛋白表达的影响
3.3.6 NS2A点突变对NS2A与 KPNA2 相互作用的影响
3.3.7 NS2A点突变感染性克隆的构建及点突变病毒株的拯救
3.3.8 NS2A点突变对ZIKV复制的影响
3.3.9 NS2A点突变对ZIKV感染的细胞中KPNA2 蛋白水平的影响
3.4 讨论
3.5 小结
第4章 核输入蛋白KPNA2对寨卡病毒复制的影响
4.1 材料
4.1.1 细胞、病毒、试剂、抗体、载体
4.1.2 主要仪器
4.2 方法
4.2.1 KPNA2点突变体的构建
4.2.2 KPNA2 点突变对KPNA2 表达水平的影响
4.2.3 KPNA2 点突变对KPNA2和LAMP2A相互作用的影响
4.2.4 KPNA2 点突变对KPNA2和NS2A相互作用的影响
4.2.5 KPNA2 敲降对ZIKV病毒复制的影响
4.2.6 KPNA2敲降对细胞活力的影响
4.2.7 图像处理及统计分析
4.3 结果
4.3.1 KPNA2 点突变对KPNA2 表达水平的影响
4.3.2 KPNA2 点突变对KPNA2和LAMP2A相互作用的影响
4.3.3 KPNA2 点突变对KPNA2和NS2A相互作用的影响
4.3.4 KPNA2 敲降对ZIKV病毒复制的影响
4.4 讨论
4.5 小结
结论
参考文献
导师简介
作者简介
致谢
本文编号：3871339
【文章页数】：136 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
abstract
英文缩写词表
引言
第一篇 文献综述
第1章 寨卡病毒研究进展
1.1 ZIKV分子生物学及病毒学特征
1.1.1 ZIKV病毒学分类
1.1.2 ZIKV形态结构和理化特性
1.1.3 ZIKV基因组结构及功能
1.2 ZIKV生命周期
1.3 ZIKV致病机制
1.3.1 ZIKV感染的趋向性
1.3.2 ZIKV感染导致细胞死亡的机制
1.3.3 宿主细胞限制因子干扰ZIKV病毒复制的机制
1.3.4 ZIKV的免疫逃避机制
1.4 ZIKV的预防与治疗
第2章 核输入蛋白
2.1 核定位信号
2.2 核运输体系
2.2.1 核孔复合物
2.2.2 核胞质转运体
2.2.3 Ran GTPase
2.3 经典核蛋白导入的分子机制
2.4 核输入蛋白KPNA的生物学功能
第3章 伴侣分子介导的自噬
3.1 CMA的发现
3.2 CMA的分子机制
3.2.1 货物分子的选择
3.2.2 HSC70 参与CMA通路
3.2.3 溶酶体受体LAMP2A的功能
3.3 CMA在生理学中的意义
3.4 CMA的临床意义
3.4.1 CMA抵抗衰老的作用
3.4.2 CMA在神经退行性疾病中的意义
3.4.3 CMA在癌症中的意义
第二篇 研究内容
第1章 寨卡病毒对核输入蛋白KPNA2的影响
1.1 材料
1.1.1 细胞、病毒、试剂、抗体
1.1.2 主要仪器
1.2 方法
1.2.1 ZIKV病毒的繁殖
1.2.2 Western Blot检测KPNA2 蛋白水平
1.2.3 RT-q PCR检测KPNA2 m RNA水平
1.2.4 不同细胞系KPNA2蛋白水平的检测
1.2.5 Western Blot检测感染时间和感染复数对KPNA2 的影响
1.2.6 图像处理及统计分析
1.3 结果
1.3.1 ZIKV感染对KPNA2 水平的影响
1.3.2 ZIKV感染时间和感染复数对KPNA2 的影响
1.4 讨论
1.5 小结
第2章 核输入蛋白KPNA2的降解途径
2.1 材料
2.1.1 细胞、病毒、试剂、抗体、载体
2.1.2 主要仪器
2.2 方法
2.2.1 KPNA2蛋白降解部位的确定
2.2.2 细胞活力测定实验检测MG132和NH4CL对细胞活力的影响
2.2.3 RT-q PCR检测MG132和NH4CL对 ZIKV感染的影响
2.2.4 KPNA2蛋白半衰期的检测
2.2.5 免疫共沉淀检测KPNA2泛素化水平
2.2.6 免疫共沉淀检测KPNA2与LAMP2A相互作用
2.2.7 激光共聚焦检测KPNA2与LAMP2A共定位
2.2.8 LAMP2A敲降细胞系的建立
2.2.9 细胞活力测定实验检测LAMP2A敲降细胞的活力
2.2.10 检测LAMP2A敲降细胞内ZIKV感染对KPNA2 水平的影响
2.2.11 图像处理及统计分析
2.3 结果
2.3.1 KPNA2蛋白降解部位的确定
2.3.2 ZIKV对 KPNA2 半衰期的影响
2.3.3 ZIKV感染对KPNA2 泛素化水平的影响
2.3.4 免疫共沉淀对KPNA2与LAMP2A相互作用的检测
2.3.5 激光共聚焦对KPNA2与LAMP2A相互作用的检测
2.3.6 LAMP2A敲降对KPNA2 的影响
2.3.7 LAMP2A敲降对ZIKV病毒导致的KPNA2 降低的影响
2.4 讨论
2.5 小结
第3章 ZIKV非结构蛋白NS2A对 KPNA2 降解作用机制
3.1 材料
3.1.1 细胞、病毒、试剂、抗体、载体
3.1.2 主要仪器
3.2 方法
3.2.1 寨卡病毒蛋白重组质粒的构建
3.2.2 Western Bolt检测寨卡病毒蛋白对KPNA2 蛋白表达水平的影响
3.2.3 不同剂量NS2A对 KPNA2 蛋白表达水平的影响
3.2.4 ZIKV NS2A与 KPNA2 之间相互作用的检测
3.2.5 LAMP2A敲降对ZIKV NS2A和 KPNA2 相互作用的影响
3.2.6 细胞活力测定实验检测NS2A质粒转染对HEK293 细胞的影响
3.2.7 ZIKV NS2A蛋白结构的预测及质粒构建
3.2.8 ZIKV NS2A截短突变体对KPNA2 重组蛋白表达的影响
3.2.9 ZIKV NS2A点突变体的构建
3.2.10 ZIKV NS2A点突变体对KPNA2 重组蛋白表达的影响
3.2.11 免疫共沉淀验证T100A点突变对NS2A与 KPNA2 之间相互作用的影响
3.2.12 T100A点突变对ZIKV病毒复制的影响
3.2.13 图像处理及统计分析
3.3 结果
3.3.1 ZIKV病毒蛋白对KPNA2 表达水平的影响
3.3.2 ZIKV NS2A与 KPNA2 之间的相互作用
3.3.3 LAMP2A敲除对NS2A与 KPNA2 相互作用的影响
3.3.4 ZIKV NS2A截短突变体对KPNA2 重组蛋白表达的影响
3.3.5 ZIKV NS2A点突变体对KPNA2 重组蛋白表达的影响
3.3.6 NS2A点突变对NS2A与 KPNA2 相互作用的影响
3.3.7 NS2A点突变感染性克隆的构建及点突变病毒株的拯救
3.3.8 NS2A点突变对ZIKV复制的影响
3.3.9 NS2A点突变对ZIKV感染的细胞中KPNA2 蛋白水平的影响
3.4 讨论
3.5 小结
第4章 核输入蛋白KPNA2对寨卡病毒复制的影响
4.1 材料
4.1.1 细胞、病毒、试剂、抗体、载体
4.1.2 主要仪器
4.2 方法
4.2.1 KPNA2点突变体的构建
4.2.2 KPNA2 点突变对KPNA2 表达水平的影响
4.2.3 KPNA2 点突变对KPNA2和LAMP2A相互作用的影响
4.2.4 KPNA2 点突变对KPNA2和NS2A相互作用的影响
4.2.5 KPNA2 敲降对ZIKV病毒复制的影响
4.2.6 KPNA2敲降对细胞活力的影响
4.2.7 图像处理及统计分析
4.3 结果
4.3.1 KPNA2 点突变对KPNA2 表达水平的影响
4.3.2 KPNA2 点突变对KPNA2和LAMP2A相互作用的影响
4.3.3 KPNA2 点突变对KPNA2和NS2A相互作用的影响
4.3.4 KPNA2 敲降对ZIKV病毒复制的影响
4.4 讨论
4.5 小结
结论
参考文献
导师简介
作者简介
致谢
本文编号：3871339
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3871339.html