重组猪胰蛋白酶原及其突变体在毕赤酵母X33中的组成型表达

发布时间：2024-03-01 21:59

　　目的:设计以P_GAP为启动子的组成型质粒,构建高效表达重组猪胰蛋白酶原的毕赤酵母X33菌株,获得重组猪胰蛋白酶。方法:首先将质粒转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,电转化至毕赤酵母X33,表达重组猪胰蛋白酶原,经肠激酶激活,纯化提取得到重组猪胰蛋白酶。结果:筛选到高效表达重组猪胰蛋白酶原的毕赤酵母X33菌株,获得了重组猪胰蛋白酶。结论:以P_GAP为启动子的质粒,转化毕赤酵母X33后表达的重组猪胰蛋白酶原避免了补加甲醇带来的危害,且操作方便,大大缩短了周期,提高了生产效率,避免了动物源性污染。

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【部分图文】：

图1X33/pGAP-PT表达上清的SDS-PAGE

突变体在胰岛素原酶切实验中胰岛素得率较高，因此，我们研究了使用PGAP、PGAP1、PGAP2、PGAP3和PGAP4启动子的突变体的胰蛋白酶原表达情况。不同启动子突变体的表达上清SDS-PAGE显示有目的蛋白表达，且X33/pGAP1-PT1、X33/pGAP4-PT1表达....

图3X33/pGAP-PT与X33/pGAP-PT1上清SDS-PAGE对比M：蛋白marker;1:X33/pGAP-PT;2:X33/pGAP-PT1

将X33/pGAP1-PT1进行5L发酵，离心取上清，对表达上清的胰蛋白酶原进行捕获、激活和纯化，从色谱图（图6）可以看到，通过苯甲醚亲和层析得到了纯度较高的胰蛋白酶，测得浓度为0.94mg/mL，比活6365U/mg，活性5983U/mL。图4X33不同启动子表....

图2X33/pGAP-PT1表达上清的SDS-PAGE

图1X33/pGAP-PT表达上清的SDS-PAGE2.3活性测定

图8X33/pGAP1-PT1的LC-MS图

图7胰蛋白酶的HPLC图3讨论

本文编号：3915885