CRISPR/Cas9介导的无外源基因插入的马铃薯基因编辑体系
发布时间：2022-12-04 13:17
近年来,基因编辑技术CRISPR/Cas9在动植物中都得到了广泛应用。在本研究中,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,将与直链淀粉合成有关的颗粒结合型淀粉合成酶基因（Granule-Bound Starch SynthaseⅠ,GBSS I）作为基因组编辑的靶基因,以大西洋、陇薯三号和费乌瑞它作为试验材料,通过基因枪转化将体外合成的核糖核蛋白RNP和mRNA传递到外植体中,实现对靶基因的敲除,以获得无外源DNA插入的马铃薯新品系。本研究以RNP为转化试剂共获得168株再生植株,其中有13株再生植株在靶位点处成功实现基因编辑,而以mRNA为转化试剂的结果还未送测序。本实验得到以下结论:1)以陇薯三号茎段作为外植体分化的愈伤组织,结构过于紧密,用基因枪轰击的方式,未能将反应试剂传递到愈伤组织中;2)以费乌瑞它的茎段作为外植体分化形成的愈伤组织,由于结构松散,导致后期不能分化成苗;3)以大西洋叶片和叶片愈伤组织作为基因枪实验的外植体,最终获得GBSS I基因敲除的转化株,基因编辑效率为0.039-0.36%。本研究说明基于CRISPR/Cas9的基因枪技术通过转化RNP的方法可对马铃薯...
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
一 前言
1.1 基因组编辑的现状与发展
1.1.1 CRISPR/Cas9 系统
1.1.2 CRISPR/Cpf1 系统
1.1.3 CRISPR/Cas13 系统
1.2 基因组编辑技术在植物中的研究进展
1.2.1 基因敲除或插入
1.2.2 单碱基诱变
1.2.3 核酸内切酶介导的活细胞成像技术
1.3 基因编辑技术在农业育种上的应用与发展
1.3.1 增加农作物产量
1.3.2 提升农作物品质
1.3.3 提高植物抗逆性
1.3.4 加速杂交育种
1.4 基因编辑在马铃薯上的研究进展
1.4.1 降低马铃薯龙葵素含量
1.4.2 改善低温糖化现象
1.4.3 马铃薯抗除草剂
1.4.4 提高马铃薯支链淀粉含量
1.4.5 马铃薯抗多酚氧化酶(PPO)
1.4.6 马铃薯抗病毒
1.4.7 马铃薯克服自交不亲和
1.5 无转基因成分且无转基因过程的基因组编辑
1.5.1 无转基因成分的基因组编辑
1.5.2 无转基因过程的基因组编辑
1.6 研究目的和意义
1.7 实验创新性
1.7.1 技术创新
1.7.2 材料创新
二 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 试剂与工具酶
2.1.3 实验仪器和设备
2.2 实验方法
2.2.1 载体构建
2.2.2 阳性菌株检测
2.2.3 sgRNA体外转录及纯化
2.2.4 Cas9 mRNA体外转录及纯化
2.2.5 金粉悬浊液的配置
2.2.6 RNP的金粉包裹
2.2.7 RNA的金粉包裹
2.2.8 基因枪轰击
2.2.9 马铃薯叶片基因枪转化
2.2.10 马铃薯叶片愈伤的基因枪转化
2.2.11 马铃薯叶片DNA的提取
2.2.12 建立PCR产物混合池
2.2.13 马铃薯试管苗的培养
三 结果
3.1 CRISPR敲除载体构建
3.1.1 载体构建
3.1.2 RNA体外转录结果
3.2 愈伤组织的培养
3.3 基因枪预实验
3.3.1 马铃薯茎段愈伤组织基因枪轰击预实验结果
3.3.2 马铃薯叶片愈伤组织基因枪预实验结果
3.3.3 马铃薯叶片组织的基因枪预实验结果
3.4 基因枪实验
3.4.1 马铃薯叶片愈伤组织基因枪实验结果
3.4.2 马铃薯叶片基因枪实验结果
3.5 PCR产物测序结果
四 讨论
4.1 CRISPR/Cas9 系统的改进与优化
4.2 基因枪轰击技术的改进与优化
五 结论
参考文献
附录
附录1 实验方法
附录2 Barcode引物
附录3 培养基配制方法
附录4 公司合成序列
附录5 DNA提取及PCR产物结果图
附录6 深度测序结果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]碱基编辑系统研究进展[J]. 宗媛,高彩霞. 遗传. 2019(09)
[2]基于体外组装核糖核蛋白形式的CRISPR/Cas9基因编辑方法研究进展[J]. 潘海峰,杨晗,于思远,李廷栋,葛胜祥. 中国生物工程杂志. 2019(01)
[3]CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis[J]. Yiyu Chen,Zhiping Wang,Hanwen Ni,Yong Xu,Qijun Chen,Linjian Jiang. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[4]新一代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1[J]. 杨帆,李寅. 生物工程学报. 2017(03)
[5]Rapid improvement of grain weight via highly efficient CRISPR/Cas9-mediated multiplex genome editing in rice[J]. Rongfang Xu,Yachun Yang,Ruiying Qin,Hao Li,Chunhong Qiu,Li Li,Pengcheng Wei,Jianbo Yang. Journal of Genetics and Genomics. 2016(08)
[6]Targeted Gene Manipulation in Plants Using the CRISPR/Cas Technology[J]. Dandan Zhang,Zhenxiang Li,Jian-Feng Li. Journal of Genetics and Genomics. 2016(05)
[7]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao. Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
[8]龙葵素在农业上的应用[J]. 李红梅,谢麦香. 山西农业. 2005(08)
硕士论文
[1]利用CRISPR/Cas9技术选育马铃薯低龙葵素、抗低温糖化和支链淀粉高的新品系[D]. 赵国超.内蒙古大学 2019
[2]应用基因编辑技术抑制马铃薯多酚氧化酶的研究[D]. 陈明俊.贵州大学 2018
本文编号：3708335
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
一 前言
1.1 基因组编辑的现状与发展
1.1.1 CRISPR/Cas9 系统
1.1.2 CRISPR/Cpf1 系统
1.1.3 CRISPR/Cas13 系统
1.2 基因组编辑技术在植物中的研究进展
1.2.1 基因敲除或插入
1.2.2 单碱基诱变
1.2.3 核酸内切酶介导的活细胞成像技术
1.3 基因编辑技术在农业育种上的应用与发展
1.3.1 增加农作物产量
1.3.2 提升农作物品质
1.3.3 提高植物抗逆性
1.3.4 加速杂交育种
1.4 基因编辑在马铃薯上的研究进展
1.4.1 降低马铃薯龙葵素含量
1.4.2 改善低温糖化现象
1.4.3 马铃薯抗除草剂
1.4.4 提高马铃薯支链淀粉含量
1.4.5 马铃薯抗多酚氧化酶(PPO)
1.4.6 马铃薯抗病毒
1.4.7 马铃薯克服自交不亲和
1.5 无转基因成分且无转基因过程的基因组编辑
1.5.1 无转基因成分的基因组编辑
1.5.2 无转基因过程的基因组编辑
1.6 研究目的和意义
1.7 实验创新性
1.7.1 技术创新
1.7.2 材料创新
二 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 试剂与工具酶
2.1.3 实验仪器和设备
2.2 实验方法
2.2.1 载体构建
2.2.2 阳性菌株检测
2.2.3 sgRNA体外转录及纯化
2.2.4 Cas9 mRNA体外转录及纯化
2.2.5 金粉悬浊液的配置
2.2.6 RNP的金粉包裹
2.2.7 RNA的金粉包裹
2.2.8 基因枪轰击
2.2.9 马铃薯叶片基因枪转化
2.2.10 马铃薯叶片愈伤的基因枪转化
2.2.11 马铃薯叶片DNA的提取
2.2.12 建立PCR产物混合池
2.2.13 马铃薯试管苗的培养
三 结果
3.1 CRISPR敲除载体构建
3.1.1 载体构建
3.1.2 RNA体外转录结果
3.2 愈伤组织的培养
3.3 基因枪预实验
3.3.1 马铃薯茎段愈伤组织基因枪轰击预实验结果
3.3.2 马铃薯叶片愈伤组织基因枪预实验结果
3.3.3 马铃薯叶片组织的基因枪预实验结果
3.4 基因枪实验
3.4.1 马铃薯叶片愈伤组织基因枪实验结果
3.4.2 马铃薯叶片基因枪实验结果
3.5 PCR产物测序结果
四 讨论
4.1 CRISPR/Cas9 系统的改进与优化
4.2 基因枪轰击技术的改进与优化
五 结论
参考文献
附录
附录1 实验方法
附录2 Barcode引物
附录3 培养基配制方法
附录4 公司合成序列
附录5 DNA提取及PCR产物结果图
附录6 深度测序结果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]碱基编辑系统研究进展[J]. 宗媛,高彩霞. 遗传. 2019(09)
[2]基于体外组装核糖核蛋白形式的CRISPR/Cas9基因编辑方法研究进展[J]. 潘海峰,杨晗,于思远,李廷栋,葛胜祥. 中国生物工程杂志. 2019(01)
[3]CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis[J]. Yiyu Chen,Zhiping Wang,Hanwen Ni,Yong Xu,Qijun Chen,Linjian Jiang. Science China（Life Sciences）. 2017(05)
[4]新一代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1[J]. 杨帆,李寅. 生物工程学报. 2017(03)
[5]Rapid improvement of grain weight via highly efficient CRISPR/Cas9-mediated multiplex genome editing in rice[J]. Rongfang Xu,Yachun Yang,Ruiying Qin,Hao Li,Chunhong Qiu,Li Li,Pengcheng Wei,Jianbo Yang. Journal of Genetics and Genomics. 2016(08)
[6]Targeted Gene Manipulation in Plants Using the CRISPR/Cas Technology[J]. Dandan Zhang,Zhenxiang Li,Jian-Feng Li. Journal of Genetics and Genomics. 2016(05)
[7]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao. Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
[8]龙葵素在农业上的应用[J]. 李红梅,谢麦香. 山西农业. 2005(08)
硕士论文
[1]利用CRISPR/Cas9技术选育马铃薯低龙葵素、抗低温糖化和支链淀粉高的新品系[D]. 赵国超.内蒙古大学 2019
[2]应用基因编辑技术抑制马铃薯多酚氧化酶的研究[D]. 陈明俊.贵州大学 2018
本文编号：3708335
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/benkebiyelunwen/3708335.html