果实成熟和品质相关基因LeETR3/Lcyb共敲除载体构建及MDHAR的初步解析
发布时间：2023-06-03 00:07
番茄因其富含番茄红素等一系列重要营养物质,是一种备受欢迎的世界性经济作物。但其成熟后极易腐烂变质,不耐运输和储藏,由此造成了重大的经济损失。因此如何延长果实货架期及保证其关键品质一直是食品领域中重要的研究方向。目前,乙烯(C2H4)被认为是促进番茄成熟的重要植物激素,进一步研究发现其受体(LeETR3)与果实成熟密切相关。另一方面,番茄红素β-环化酶(Lcyb)是代谢番茄红素形成具环类胡萝卜素的关键酶,对于番茄红素水平调控至关重要。因此本文第一部分试图运用生物学方法CRISPR/Cas9技术同时突变LeETR3与Lcyb以期达到延迟果实成熟并保证其番茄红素含量的目的。本实验首先构建了含潮霉素(Hyg)抗性的CRISPR/Cas9Pubi::AtU::LeETR3/Lcyb共敲除载体,但在后续实验中发现番茄AC对Hyg极其敏感,且Hyg筛选AC阳性愈伤组织的最适浓度范围在5 mg/L以下,不易筛选。因此本文又构建了含卡那(Kana)抗性的CRISPR/Cas9P35s::AtU::LeETR3/Lcyb,CRISPR/Cas9::AtU::LeETR3多靶点敲除载体,并将其成功转入番茄中...
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
ABSTRACT
英文缩写符号及中英文对照表
第一章 文献综述
1.1 延长番茄货架期及提高番茄品质的研究进展
1.1.1 番茄的作用及储存现状
1.1.2 番茄红素的作用及意义
1.1.3 番茄成熟的影响因子
1.1.4 延长番茄货架期的常用方法
1.1.5 转基因技术的发展
1.1.6 基因编辑技术的简介
1.1.7 CRISPR/Cas技术的研究进展
1.2 MDHAR的功能及其相关基因的研究进展
1.2.1 抗坏血酸的简介
1.2.2 MDHAR的简介
1.3 本研究的目的、内容及意义
第二章 果实成熟和品质相关基因LeETR3/Lcyb共敲除载体构建
2.1 实验材料与方法
2.1.1 植物材料
2.1.2 质粒与菌株
2.2 主要设备与仪器
2.3 主要试剂
2.3.1 分子生物学常用酶和试剂盒
2.3.2 常用生化试剂
2.4 常用试剂与培养基的配制
2.4.1 SDS缓冲液配制
2.4.2 TAE缓冲液配制
2.4.3 MS常用试剂配制
2.4.4 植物组织基本培养基配方
2.4.5 LB基础培养基配方
2.5 分子实验方法
2.5.1 CRISPR/CAS9载体构建基本步骤
2.5.2 靶位点选择及靶点引物设计
2.5.3 质粒提取
2.5.4 表达盒与接头靶点的连接
2.5.5 表达盒的扩增
2.5.6 核酸检测琼脂糖凝胶电泳
2.5.7 产物纯化
2.5.8 质粒大提
2.5.9 双元载体的构建
2.5.10 农杆菌EHA105化转感受态的制备
2.5.11 双元载体质粒的农杆感受态的化转
2.6 植物组织培养方法步骤
2.6.1 发种子
2.6.2 洗种子
2.6.3 预培养
2.6.4 侵染
2.6.5 Kana筛选
2.6.6 Hyg筛选
2.6.7 生根
2.6.8 移苗
2.7 番茄培养条件
2.8 结果与分析
2.8.1 番茄目的基因靶位点的获得
2.8.2 植物表达载体CRISPR双元载体构建
2.8.3 植物表达载体在番茄中的遗传转化
2.9 结论
2.10 讨论与展望
第三章 猕猴桃基因MDHAR功能的初步解析
3.1 材料与方法
3.1.1 植物材料
3.1.2 质粒与菌株
3.2 主要设备
3.3 主要试剂
3.3.1 常用生化试剂
3.3.2 抗坏血酸的测定试剂配方
3.3.3 MDHAR测定Buffer配方
3.4 试验方法
3.4.1 MDHAR转基因株系筛选
3.4.2 引物设计
3.4.3 Trizol法提取RNA
3.4.4 mRNA反转录为cDNA
3.4.5 RT-PCR分析
3.4.6 AsA测定
3.4.7 植物中MDHAR酶活的测定
3.4.8 拟南芥的培养条件
3.5 实验结果与分析
3.5.1 RT-PCR分析MDHAR的表达情况
3.5.2 转基因株系的MDHAR酶活测定分析
3.5.3 转基因株系的AsA测定分析
3.6 结论
3.7 讨论与展望
参考文献
攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况
本文编号：3828284
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
ABSTRACT
英文缩写符号及中英文对照表
第一章 文献综述
1.1 延长番茄货架期及提高番茄品质的研究进展
1.1.1 番茄的作用及储存现状
1.1.2 番茄红素的作用及意义
1.1.3 番茄成熟的影响因子
1.1.4 延长番茄货架期的常用方法
1.1.5 转基因技术的发展
1.1.6 基因编辑技术的简介
1.1.7 CRISPR/Cas技术的研究进展
1.2 MDHAR的功能及其相关基因的研究进展
1.2.1 抗坏血酸的简介
1.2.2 MDHAR的简介
1.3 本研究的目的、内容及意义
第二章 果实成熟和品质相关基因LeETR3/Lcyb共敲除载体构建
2.1 实验材料与方法
2.1.1 植物材料
2.1.2 质粒与菌株
2.2 主要设备与仪器
2.3 主要试剂
2.3.1 分子生物学常用酶和试剂盒
2.3.2 常用生化试剂
2.4 常用试剂与培养基的配制
2.4.1 SDS缓冲液配制
2.4.2 TAE缓冲液配制
2.4.3 MS常用试剂配制
2.4.4 植物组织基本培养基配方
2.4.5 LB基础培养基配方
2.5 分子实验方法
2.5.1 CRISPR/CAS9载体构建基本步骤
2.5.2 靶位点选择及靶点引物设计
2.5.3 质粒提取
2.5.4 表达盒与接头靶点的连接
2.5.5 表达盒的扩增
2.5.6 核酸检测琼脂糖凝胶电泳
2.5.7 产物纯化
2.5.8 质粒大提
2.5.9 双元载体的构建
2.5.10 农杆菌EHA105化转感受态的制备
2.5.11 双元载体质粒的农杆感受态的化转
2.6 植物组织培养方法步骤
2.6.1 发种子
2.6.2 洗种子
2.6.3 预培养
2.6.4 侵染
2.6.5 Kana筛选
2.6.6 Hyg筛选
2.6.7 生根
2.6.8 移苗
2.7 番茄培养条件
2.8 结果与分析
2.8.1 番茄目的基因靶位点的获得
2.8.2 植物表达载体CRISPR双元载体构建
2.8.3 植物表达载体在番茄中的遗传转化
2.9 结论
2.10 讨论与展望
第三章 猕猴桃基因MDHAR功能的初步解析
3.1 材料与方法
3.1.1 植物材料
3.1.2 质粒与菌株
3.2 主要设备
3.3 主要试剂
3.3.1 常用生化试剂
3.3.2 抗坏血酸的测定试剂配方
3.3.3 MDHAR测定Buffer配方
3.4 试验方法
3.4.1 MDHAR转基因株系筛选
3.4.2 引物设计
3.4.3 Trizol法提取RNA
3.4.4 mRNA反转录为cDNA
3.4.5 RT-PCR分析
3.4.6 AsA测定
3.4.7 植物中MDHAR酶活的测定
3.4.8 拟南芥的培养条件
3.5 实验结果与分析
3.5.1 RT-PCR分析MDHAR的表达情况
3.5.2 转基因株系的MDHAR酶活测定分析
3.5.3 转基因株系的AsA测定分析
3.6 结论
3.7 讨论与展望
参考文献
攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况
本文编号：3828284
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/boshibiyelunwen/3828284.html