牛血红蛋白ACE抑制活性肽序列的鉴定、预测及其抑制机制研究

发布时间：2020-11-21 23:26

　　 高血压是导致冠心病、外周动脉疾病、中风等一系列心脑血管疾病的主要风险因子[1]。2014年全球成人高血压发病率已达到22%，如何有效降低血压现已成为当前研究的焦点问题。血管紧张素转化酶（ACE，EC3.4.15.1）在调节机体血压和心血管功能方面起着重要作用，而有效抑制ACE活性已成为当前缓解和治疗高血压的一线策略之一。由于大部分化学合成或修饰的ACE抑制剂存在着潜在的肾功能损害、干咳、皮疹、高钾血症、血管神经性水肿等副作用，因此对它们的使用应十分谨慎；而源自天然食物蛋白的ACE抑制活性肽的作用效果温和、安全，因而渐渐受到人们的重视。牛血作为肉牛屠宰加工的主要副产物，因其腥味较重、口感不佳、保存困难等缺点，迄今仍未得到有效开发利用。但是牛血中富含血红蛋白，是制取ACE抑制活性肽的优良资源，因此，具有极大的开发潜能。当前，采用传统的水解-分离-纯化方法制备ACE抑制活性肽已成体系，但该方法却存在着耗资较大、周期较长等问题。为了应对这一挑战，计算机模拟技术已逐渐应用于ACE抑制活性肽的开发及ACE抑制分子机制的研究。 本研究以牛血红蛋白为原料，采用传统方法和计算机辅助建模方法对牛血红蛋白序列中封存的ACE抑制活性肽进行序列鉴定和预测，探讨了ACE抑制活性肽降解小肽及其协同作用对ACE抑制活性的影响，并通过分子对接技术研究牛血红蛋白源ACE抑制活性肽与ACE分子之间的相互作用，探索活性肽的ACE抑制分子机制。 首先，采用体外模拟胃肠道消化水解、超滤、凝胶柱层析分离纯化获得了高活力的ACE抑制活性肽组分，通过高效液相色谱-串联三重四极杆线性离子阱复合质谱鉴定得到了7条活性肽序列，其中Phe-Leu和Thr-Tyr具有较好的ACE抑制活性，IC50分别为290.66μM和96.43μM，其余5条二肽IC50均在1000μM以上。构效关系分析表明活性肽两端的氨基酸残基对其ACE抑制能力有着重要作用，C端含有芳环/杂环类氨基酸残基、疏水性氨基酸残基和/或N端含有疏水性氨基酸残基均能提高活性肽的ACE抑制能力。分子对接结果表明Phe-Leu和Thr-Tyr主要通过氢键、疏水相互作用等非共价分子间作用来维持活性肽-ACE体系稳定。 为提高获取牛血红蛋白ACE抑制活性肽序列的效率，本研究采用计算机辅助建模技术进行活性肽序列预测。利用Peptide Cutter模拟pH值为1.3条件下胃蛋白酶水解牛血红蛋白的过程，建立牛血红蛋白虚拟水解2~5肽库，同时采用药效团模型技术建立了基于21条ACE抑制活性肽化学结构与空间特征的ACE抑制活性肽预测模型，并对牛血红蛋白虚拟水解2~5肽库进行筛选，获得了Ala-Ser-His-Leu和Try-Thr-Gln-Arg-Phe两条肽序列，其实验IC50分别为3.13mM和42.82μM。分子对接结果表明两条肽均满足非竞争性抑制模式特征。 为提高计算机辅助建模预测的准确性，采用三层误差反向传播神经网络模型建立了一个基于24条ACE抑制活性五肽结构、空间、热力学和电子特征的预测模型，同时利用Peptide Cutter的模拟胃蛋白酶（pH1.3、pH2）和胰蛋白酶水解牛血红蛋白的过程，并建立了牛血红蛋白虚拟水解五肽库。结果表明Try-Thr-Gln-Arg-Phe具有最高的预测活性序列。由于该五肽序列同时被两个预测模型筛选出来，本研究采用了柔性对接方式对其ACE抑制分子机制进行进一步分析，发现活性肽谷氨酰胺残基亲水侧链上的羰基氧与Zn2+之间产生的配位作用可能是该五肽发挥ACE抑制作用的关键。 最后，本论文研究了Try-Thr-Gln-Arg-Phe的降解行为对ACE抑制活力的影响以及该五肽的降解小肽之间的ACE抑制协同作用。发现降解小肽中的Thr-Gln-Arg和Try-Thr保持了较高的ACE抑制活力，并且降解小肽Thr-Gln和Gln-Arg，Try-Thr-Gln和Arg-Phe之间存在显著的正协同作用。分子对接结果表明降解小肽之间的ACE抑制正协同作用更倾向于在两条活性肽分别满足不同ACE抑制模式特征的组合中发生。 本研究为进一步阐明生物活性肽的ACE抑制分子机制做出了一定贡献，具有重要的现实意义和理论意义。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q51;TQ464.7
【部分图文】：

吉林大学博士学位论文（Bradykinin，BK，Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg），赖氨酰缓 Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg ） 和 甲 硫 氨 酰 - 赖 氨 酰 缓 激Met-Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro -Phe-Arg）三种。三者中，BK 表现出降压活性，一方面，它可以直接作用于缓激肽 B2受体，促进血管舒张，降；另一方面，它与可以促进前列腺素合成，前列腺素能使血管平滑肌松弛外周血管阻力，从而有效降低血压。ACE 作为激肽酶之一（激肽酶 II），能 降解为无活性的片段，使之无法发挥降压作用。图 1.1[11]展示了ACE 在 RAS 中调节机体血压的机制。综上所述，有效的抑制 ACE 活性，是调节血压的关键所在。

含有一个与 sACE 的 C 端结构域高度一致的同源结构域；tACE 从第 73 个碱基开始，其序列与 sACE 的 C 端完全相同。ACE 的 C 结构域包含一个保守的锌结合模体HEXXH，该结构域也已被证实为ACE调控血压和心血管功能的主导性位点[17, 18]。1.1.4 ACE 的三维结构特征糖构型在蛋白质表面的灵活性和异质性是导致蛋白糖基化，进而阻碍蛋白质晶体生成的主要因素[18]。ACE蛋白质表面具有16个潜在N-糖基化位点，其晶体生长极为困难，这导致 ACE 的 C 结构域（PDB ID：1O86）和 N 结构域（PDB ID：2C6N）三维结构直到 2003 年之后才被 Natesh[19]和 Corradi[12]等人陆续解出。ACE的 C 结构域和 N 结构域具有约 60%的序列一致性，它们的晶体结构也展示出二者在结构上的高度同源性（图 1.2）。

图 1.3 ACE 活性中心假定工作模型[10]Figure 1.3 Hypothetical working model of ACE active centerCE 的催化活性中心位于其 Zn2+附近，在 C 结构域中，Zn2+与 His 38 Glu 411 通过配位键形成较稳定的四面体结构；在 N 结构域中，Zn2+His 365 和 Glu 389 通过配位键形成较稳定的四面体结构。小分子可分子内部的疏水空腔进入其活性中心，通过与 ACE 活性中心氨基酸残键、范德华力、静电力、亲/疏水作用以及与 Zn2+之间的配位作用等变ACE活性构象，从而调节 ACE的催化活性。Ondetti 和Cushman 等研究了小分子抑制剂对 ACE 活性中心的调节机制，发现 ACE 活性于其 S1'和 S1 亚位点（活性口袋）之间狭窄的通道中，而保守的锌结XH 的稳定是维持 ACE 活性的关键因素。他们认为 ACE 催化活性中心
【参考文献】

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1 张婷;庄红;薛培宇;刘静波;;血红素铁功能及其二价铁保护探索[J];肉类研究;2008年03期

本文编号：2893755