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CCR2自分泌在胚胎附植期猪子宫内膜的表达分布和功能研究

发布时间:2016-11-25 20:22

  本文关键词:CCL2-CCR2自分泌在胚胎附植期猪子宫内膜的表达分布和功能研究,,由笔耕文化传播整理发布。


《中国农业大学》 2015年

CCL2-CCR2自分泌在胚胎附植期猪子宫内膜的表达分布和功能研究

樊自尧  

【摘要】:产仔数是猪的重要经济性状,胚胎附植期分子机理研究对猪产仔数的提高具有重要意义。CCL2(CC chemokine ligand2, CC趋化因子配体2)被报道表达在人、羊等附植阶段的子宫内膜,但调节机制和生物学功能还不清楚。本论文针对CCL2和其受体CCR2(CC chemokine receptor2)CC趋化因子配体2)在胚胎附植期猪子宫内膜的表达调控和其影响猪子宫内膜的胚胎附植的生物学功能进行了研究。 本研究首先对CCL2和CCR2在猪子宫内膜的表达进行定位,结果发现CCL2和CCR2同时表达在猪子宫内膜腔上皮细胞。通过对妊娠第13天、第18天和第24天,以及发情周期第13天和第18天的猪子宫内膜进行实验条件相同的免疫组化来检测CCL2和CCR2的表达量的变化。结果表明,CCL2和CCR2的表达量发情周期高于胚胎附植期;在发情周期第13天子宫内膜腔上皮表达的CCL2和CCR2高于第18天的子宫内膜腔上皮;CCL2和CCR2在所有附植点腔上皮表达低于附植点间;附植点和附植点间的CCR2表达量在在妊娠第13天开始表达量升高,妊娠第18天达到峰值,之后开始下降;附植点和附植点间的CCL2的表达量随妊娠进行而逐渐下降,说明CCL2和CCR2的变化可能与胚胎附植期的猪子宫内膜调控机制有关。 实验建立了猪原代子宫内膜腔上皮细胞的培养方法,获得了原代猪子宫内膜腔上皮细胞。为了研究CCL2和CCR2之间是否存在自分泌现象,对细胞分别添加猪CCL2重组蛋白、CCR2阻断剂(RS102895)和RS102895+CCL2重组蛋白等处理,以及对照组。结果表明,CCL2可以促进细胞表达CCR2,添加RS102895或RS102895+CCL2重组蛋白的细胞,会剧烈上调CCR2的表达;各试验组细胞表达CCL2mRNA的变化没有显著变化。说明CCL2和CCR2之间存在正调控方式的自分泌,CCR2被RS102895阻断后,CCR2出现剧烈的上调。实验检测了孕酮对猪子宫内膜腔上皮细胞表达CCL2和CCR2的影响。向原代猪子宫腔上皮细胞中添加孕酮,用Westernblotting检测CCL2和CCR2的表达量,发现孕酮可以促进CCL2和CCR2的表达;向卵巢切除的母猪注射孕酮,免疫组化结果显示,注射孕酮的母猪的子宫内膜腔上皮细胞CCL2和CCR2的表达量显著高于对照组。说明孕酮对猪子宫内膜腔上皮表达CCL2和CCR2具有促进作用。 为了挖掘CCL2-CCR2信号在猪子宫内膜腔上皮细胞存在的自分泌现象的生物学意义,实验分别用CCL2的重组蛋白,抗CCL2中和抗体与对照处理原代猪子宫内膜腔上皮细胞,24小时后提取mRNA进行转录组测序,实验组分别与对照组进行比较,利用DE-Seq的方法并限定FC大于2或小于0.5,FDR小于0.01和RPKM大于10获得差异基因,对照组和CCL2蛋白组没有获得差异基因,对照组和CCL2中和抗体组获得48个差异基因,其中包括VEGFA、CEBPB、MIF、 MMP15、CLDN3等被报道与胚胎附植相关的11个基因。检测了CCL2对细胞增殖的影响,CCL2中和抗体添加到细胞中,处理不同时间后CCK8检测细胞增殖发现高浓度CCL2可以抑制细胞增殖,但CCL2重组蛋白添加后细胞增殖情况与对照组没有显著差异。实验通过血清饥饿猪子宫内膜腔上皮细胞模型检测了CCL2-CCR2对饥饿导致的细胞自噬作用,结果显示CCL2促进自噬,防止细胞死亡。综上,合适浓度的CCL2-CCR2可以维持猪子宫内膜腔上皮细胞的正常存活,对胚胎附植的顺利进行具有重要的意义。

【关键词】:
【学位授予单位】:中国农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S828
【目录】:

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