MicroRNA调控元件鉴定及调控成肌细胞分化的功能研究

发布时间：2022-11-03 17:57

　　骨骼肌作为哺乳动物体重占比最高的组织,其生长发育直接影响畜牧业产肉效率,因此对骨骼肌细胞增殖分化的调控研究尤为重要。多项研究表明,mi RNAs与骨骼肌生长发育调控密切相关。然而,mi RNAs在这一过程中发挥的具体机制,如控制自身转录的调控元件、调控骨骼肌生长发育的关键作用通路等,仍然有待探究。本研究以C2C12成肌细胞为模型,运用染色质可及性及高通量测序（Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing,ATAC-seq）和染色质免疫共沉淀及高通量测序（Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing,Ch IP-seq）等表观遗传学策略,解析细胞成肌分化过程中mi RNAs基因自身表达的调控机制。通过转录组分析策略和功能验证全面探究了mi RNAs调控细胞成肌分化的关键分子途径。另外,初步绘制了mi RNAs在猪骨骼肌不同发育时期的时序表达特征。本研究主要结果如下:（1）建立了C2C12细胞诱导成肌模型,在细胞分化0D、1D、2D和4D不同时间点... 

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【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
缩略词表(ABBREVIATIONS)
1 前言
    1.1 研究问题的由来
    1.2 文献综述
        1.2.1 骨骼肌发育及成肌细胞分化的研究进展
        1.2.2 MicroRNAs调控成肌细胞分化的研究进展
        1.2.3 Hippo信号通路在成肌细胞分化中的作用
        1.2.4 MAPK/Erk信号通路与成肌细胞分化相关研究进展
        1.2.5 哺乳动物基因组调控元件鉴定进展
        1.2.6 MicroRNAs调控元件的研究进展
    1.3 研究目的和意义
2 材料与方法
    2.1 技术路线
    2.2 实验材料
        2.2.1 细胞系、载体和菌株
        2.2.2 主要试剂及设备
    2.3 实验方法
        2.3.1 细胞培养
        2.3.2 核酸提取及检测
        2.3.3 RNA反转录及检测
        2.3.4 实时荧光定量PCR(Q-PCR)
        2.3.5 细胞免疫荧光
        2.3.6 蛋白质免疫印迹技术(Western Blotting)
        2.3.7 siRNA转染
        2.3.8 双荧光素酶报告基因
        2.3.9 构建慢病毒介导的CRISPR/Cas9敲低细胞系
        2.3.10 细胞ATAC-seq
        2.3.11 Agilent质控
        2.3.12 miRNA测序
        2.3.13 mRNA测序
        2.3.14 高通量数据分析
3 结果
    3.1 成肌分化不同时期差异表达miRNAs
        3.1.1 C2C12细胞诱导成肌四个时间点的分化模型建立
        3.1.2 成肌细胞RNA质量检测
        3.1.3 成肌细胞诱导成肌不同阶段miRNAs测序数据比对
        3.1.4 C2C12细胞诱导成肌过程中差异miRNAs表达分析
    3.2 细胞成肌分化过程中miRNAs差异表达的调控因子
        3.2.1 C2C12细胞ATAC-seq文库构建
        3.2.2 C2C12细胞ATAC-seq数据质量检测
        3.2.3 差异表达miRNAs调控区域可视化分析
        3.2.4 差异表达miRNAs的染色质开放区域调控研究
        3.2.5 调控miRNAs差异表达的转录因子鉴定
    3.3 成肌分化过程中差异miRNAs靶基因及功能富集分析
        3.3.1 成肌分化过程中差异miRNAs靶基因预测
        3.3.2 成肌分化过程中差异miRNAs功能富集分析
    3.4 miRNAs参与Hippo通路调控成肌分化的潜在调控网络
        3.4.1 miRNAs协同参与Hippo信号通路的潜在网络关系构建
        3.4.2 miRNAs靶基因的双荧光素酶报告基因载体系统验证
    3.5 Hippo信号通路调控细胞成肌分化的研究
        3.5.1 利用siRNA抑制Hippo信号通路效应因子Yap1表达
        3.5.2 利用siRNA抑制Hippo信号通路效应因子Wwtr1表达
        3.5.3 利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9 系统抑制Wwtr1表达
        3.5.4 抑制Hippo信号通路对细胞成肌分化的影响
    3.6 miRNAs参与MAPK/Erk信号通路调控成肌分化的潜在调控网络
    3.7 猪骨骼肌发育过程miRNAs时序表达规律分析
4 讨论
    4.1 C2C12成肌分化过程中差异表达miRNAs
    4.2 染色质可及性和转录因子对miRNAs基因的转录调控
    4.3 Hippo信号通路对成肌细胞分化的调控
    4.4 MAPK/Erk信号通路对成肌细胞分化的作用
5 小结
    5.1 本研究的主要结论
    5.2 本研究的创新点与特色
    5.3 本研究不足之处与下一步工作建议
参考文献
附录
攻读学位期间发表的论文题录
致谢



本文编号：3700360